安芳蘭，張 榮，武發(fā)菊，董文教，楊惠清，劉學(xué)榮，萬(wàn)玉林，楊進(jìn)才，殷 宏

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046）

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中污染的類(lèi)型及控制策略探討

安芳蘭1，張 榮1，武發(fā)菊1，董文教1，楊惠清1，劉學(xué)榮1，萬(wàn)玉林1，楊進(jìn)才1，殷 宏2*

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046）

細(xì)胞污染是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中面臨的主要問(wèn)題。本文從細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中污染產(chǎn)生的來(lái)源、種類(lèi)及控制策略等方面對(duì)規(guī)?；囵B(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)的污染類(lèi)型及防控手段進(jìn)行綜述，為提高細(xì)胞培養(yǎng)水平、防治細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可能出現(xiàn)的污染狀況及研究新的去除污染的手段提供新的思路，為有效減少和控制污染、降低損失，提高生物制品的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞污染；污染控制

污染是動(dòng)物規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中長(zhǎng)期面臨的問(wèn)題，培養(yǎng)環(huán)境中諸多因素都可能造成污染而影響生物制品的產(chǎn)量，例如物理、化學(xué)及生物因素等。自1962年Capskti等首創(chuàng)了有關(guān)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)之后，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模開(kāi)始擴(kuò)大，廣泛應(yīng)用于口蹄疫等病毒疫苗的生產(chǎn)，為疫苗、干擾素和單克隆抗體等生物制品的生產(chǎn)提供了有效的技術(shù)途徑。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)無(wú)菌操作過(guò)程，對(duì)培養(yǎng)條件要求比較苛刻。目前，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)生物制品企業(yè)為了避免微生物及其他有害因素的影響而建有標(biāo)準(zhǔn)化的無(wú)菌環(huán)境，以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求，但是，污染問(wèn)題還是不能得到及時(shí)解決，給研究及操作人員帶來(lái)極大的困擾。因此，了解規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中污染的來(lái)源、種類(lèi)及其危害性，建立規(guī)范的操作方法及規(guī)章制度，可有效防止污染，盡可能地保證規(guī)?；a(chǎn)體系的穩(wěn)定性和可靠性。

1 污染的來(lái)源

1.1 外源性污染

1.1.1 原輔材料 水是生物制品原料的主要溶劑，一切營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)只有溶于水才易被細(xì)胞吸收，代謝產(chǎn)物也需溶于水才能排泄，所有的生化反應(yīng)必須在溶液狀態(tài)下才能很好的作用。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中水是不可缺少的原材料，因此也就成了細(xì)胞培養(yǎng)中的污染源之一。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。配制培養(yǎng)液應(yīng)使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水，存放時(shí)間一般不應(yīng)超過(guò)2周，依據(jù)國(guó)家藥典，其pH范圍應(yīng)為5～7，電導(dǎo)率＜10 us/cm。

培養(yǎng)液是細(xì)胞賴(lài)以生存的體外環(huán)境，也為細(xì)胞生長(zhǎng)提供主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。如果配制培養(yǎng)液的化學(xué)試劑及添加物不純，配液罐、閥門(mén)、管道及濾器等驗(yàn)證不合格或滅菌不徹底都會(huì)造成培養(yǎng)液的污染。

動(dòng)物血清作為原輔材料是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的一種重要的天然培養(yǎng)基，同時(shí)存在潛在的生物及化學(xué)污染來(lái)源。由于血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，不同廠商的生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)質(zhì)量也各不相同，使得血清中許多蛋白及生長(zhǎng)因子的濃度也存在很大的差異，取材中可能帶入支原體、病毒，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響。因此，不同的處理方式和工藝等都是影響血清質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中所用到的培養(yǎng)器皿及容器多種多樣，如各種玻璃制品和不銹鋼生物反應(yīng)器等。培養(yǎng)器皿及容器在清洗過(guò)程中殘留的變性劑或洗衣粉等是最常見(jiàn)的化學(xué)性污染來(lái)源。

1.1.2 操作環(huán)境 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)一般在潔凈度為萬(wàn)級(jí)以上的潔凈室或者是超凈工作臺(tái)內(nèi)操作。生產(chǎn)中萬(wàn)級(jí)以上潔凈室內(nèi)部氣流一般為亂流，內(nèi)含局部百級(jí)潔凈度的層流罩。層流罩的氣流為雙向垂直流，常規(guī)操作均在層流罩下進(jìn)行。超凈工作臺(tái)作為級(jí)別較高的操作環(huán)境，能較好地保持臺(tái)面無(wú)菌及環(huán)境的安全性，但其使用過(guò)久易造成塵埃堵塞，例如過(guò)濾網(wǎng)罩若未定期更換或長(zhǎng)久不更換，污染空氣易進(jìn)入操作區(qū)等，都會(huì)造成培養(yǎng)室內(nèi)空氣污染。

1.1.3 操作人員 人員是生物制品生產(chǎn)操作中最不確定的因素，每天都會(huì)攜帶大量的灰塵，而細(xì)菌和病毒則附著在灰塵中，如果不按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，例如進(jìn)出無(wú)菌室沒(méi)有必要的滅菌措施、操作前不檢查設(shè)備和環(huán)境是否達(dá)標(biāo)等，則會(huì)使無(wú)菌區(qū)域的環(huán)境平衡遭到破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中試驗(yàn)人員是否操作規(guī)范，是否嚴(yán)格遵守?zé)o菌工作流程，是細(xì)胞污染的一個(gè)主要因素。

1.2 內(nèi)源性污染

內(nèi)源性污染雖然不似外源性污染廣泛，但內(nèi)源性污染的檢測(cè)和清除更為困難。主要表現(xiàn)為細(xì)胞株建庫(kù)時(shí)存在的潛在污染，如制備細(xì)胞的組織或器官本身攜帶有病毒或支原體等。

2 污染的種類(lèi)

2.1 細(xì)菌污染

細(xì)菌類(lèi)的污染最為常見(jiàn)和廣泛，大多屬于外源性的污染。一般比較容易檢測(cè)和鑒定，通常通過(guò)肉眼觀察或光鏡下檢查就可做出初步鑒定，最后采用細(xì)菌培養(yǎng)和染色等方法做出進(jìn)一步鑒定。常見(jiàn)的細(xì)菌污染有革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌等）和革蘭氏陽(yáng)性菌（如葡萄球菌等）[1]，細(xì)菌污染細(xì)胞后，多數(shù)情況下細(xì)胞培養(yǎng)液短時(shí)間內(nèi)變黃，出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，pH值降低，倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面及周?chē)写罅考?xì)菌存在，細(xì)胞停止生長(zhǎng)并有中毒表現(xiàn)。

2.2 真菌污染

真菌類(lèi)的污染也是常見(jiàn)的污染類(lèi)型，大多也屬于外源性的污染，比較容易檢測(cè)和鑒定。最常見(jiàn)的真菌有曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。真菌污染細(xì)胞后多在培養(yǎng)液中形成黃色或白色漂浮物，一般肉眼可見(jiàn)，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液不變渾濁，4 d左右才可在顯微鏡下觀察到絲狀或者是鏈狀的菌絲，周期較長(zhǎng)。

2.3 支原體污染

支原體是一類(lèi)無(wú)細(xì)胞壁、大小介于細(xì)菌和病毒之間（直徑在0.13～0.18 μm）并獨(dú)立生活的微生物，可穿過(guò)0.22 μm的孔徑濾膜[2]。支原體分布廣泛，主要存在于污水、土壤、植物、動(dòng)物和人體中，以腐生、共生或寄生的方式在規(guī)模化細(xì)胞培養(yǎng)和生物制品生產(chǎn)過(guò)程中造成污染。

支原體污染多屬于外源性污染，也有內(nèi)源性的，感染力高且不易被檢測(cè)，在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中極為常見(jiàn)。支原體污染細(xì)胞后，生長(zhǎng)緩慢，早期很難發(fā)現(xiàn)，顯微鏡下常可見(jiàn)到細(xì)胞核及胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的顆?；蚩张荩唐趦?nèi)培養(yǎng)液不變渾濁。支原體污染對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖、形態(tài)、細(xì)胞代謝、遺傳學(xué)以及細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性都將產(chǎn)生不同程度的影響，是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)工作中亟待解決的重要問(wèn)題之一。其種類(lèi)不同，對(duì)細(xì)胞的影響也不同，一般支原體的污染可使細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢或完全終止，最終細(xì)胞發(fā)生病變，但有些經(jīng)支原體污染的細(xì)胞在經(jīng)過(guò)多次連續(xù)傳代或長(zhǎng)期培養(yǎng)后，仍然表現(xiàn)出基本正常的生長(zhǎng)，這樣給檢測(cè)和清除工作帶來(lái)了很多困難。

2.4 病毒污染

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的病毒污染一般來(lái)自動(dòng)物血清或者是管理不嚴(yán)的動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)，多為外源性污染，也有內(nèi)源性的（如建立細(xì)胞株時(shí)產(chǎn)生的污染）。外源性的污染大部分主要來(lái)源于牛腹瀉病毒(BVDV)中的非細(xì)胞病變株，預(yù)計(jì)有70%以上的胎牛血清中均存在這種病毒。大部分外源和內(nèi)源的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞后，被感染細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生形態(tài)和細(xì)胞病理現(xiàn)象，可用血細(xì)胞吸附試驗(yàn)、免疫熒光抗體及電子顯微鏡等方法有效地檢測(cè)上述病毒。

2.5 交叉污染

交叉污染一般來(lái)自細(xì)胞建株和細(xì)胞傳代過(guò)程中兩種或兩種以上細(xì)胞之間的混合污染。在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，細(xì)胞種類(lèi)不同，其理化特性、培養(yǎng)操作模式也不盡相同，若在同一無(wú)菌環(huán)境區(qū)域操作，所用試驗(yàn)材料極易導(dǎo)致不同種細(xì)胞間交叉污染，使細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)活性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞特性的改變。

3 污染的控制

3.1 外源性污染

3.1.1 原輔材料污染的控制 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中要特別注意防止培養(yǎng)液的污染，要做到這一點(diǎn)采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟是前提，配制好的培養(yǎng)液采用過(guò)濾除菌法進(jìn)行除菌，確保所用的濾器、儲(chǔ)存培養(yǎng)液的容器以及操作過(guò)程等均嚴(yán)格無(wú)菌。此外，為了避免培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分或添加的各種試劑等引起的化學(xué)性污染，培養(yǎng)過(guò)程中所使用的所有化學(xué)物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并且要經(jīng)過(guò)權(quán)威機(jī)構(gòu)的鑒定，操作人員最好對(duì)上述成分做進(jìn)一步的純度鑒定。

動(dòng)物血清為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必需的生長(zhǎng)因子，同時(shí)又是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中潛在的生物及化學(xué)污染的來(lái)源[3]。培養(yǎng)細(xì)胞所用的血清必須儲(chǔ)存于-20℃或者是-70℃的環(huán)境。為了保證試驗(yàn)及生產(chǎn)工藝的重復(fù)性，最好選用同一批次的血清，并且在添加血清之前一定要對(duì)血清進(jìn)行過(guò)濾和輻照等處理，以便除去血清自身攜帶的內(nèi)源性微生物。因此，研究和開(kāi)發(fā)無(wú)血清培養(yǎng)基已成為各生物制品公司研究的趨勢(shì)。

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)使用到各種不同類(lèi)型及規(guī)模的培養(yǎng)器材，其規(guī)模和構(gòu)形設(shè)計(jì)會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)中氣體的交換、濕度、培養(yǎng)液的pH值甚至細(xì)胞生長(zhǎng)密度[4]。培養(yǎng)細(xì)胞所用的器材首先需經(jīng)過(guò)注射用水清洗，再經(jīng)嚴(yán)密的包裝和滅菌，最好采用內(nèi)外兩層包裝，滅菌要徹底，一般采用干烤或蒸汽滅菌：如高溫干烤滅菌時(shí)要注意溫度的設(shè)定和維持的時(shí)間；高壓蒸汽滅菌時(shí)應(yīng)注意壓力、溫度和時(shí)間，壓力應(yīng)保持在0.103 MPa以上，溫度121℃，時(shí)間大于30 min，并且已滅菌的培養(yǎng)器材要嚴(yán)格控制使用期限，在妥善保管的條件下，天氣干燥的春秋季節(jié)可使用1周，炎熱潮濕的夏季可使用2～3 d。

培養(yǎng)器材的特性及滅菌過(guò)程的差異也會(huì)對(duì)培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響，塑料制品在生產(chǎn)過(guò)程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。因此，根據(jù)生產(chǎn)工藝，儲(chǔ)存不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器，因?yàn)榫凭?qiáng)酸、強(qiáng)堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分[5]。此外，各生物反應(yīng)器、管道連接及工藝等進(jìn)入生產(chǎn)線前均需做無(wú)菌驗(yàn)證。

3.1.2 操作環(huán)境污染的控制 規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌室具有嚴(yán)格的要求，才能保證操作過(guò)程的無(wú)菌：首先須有防止微生物污染和有害因素影響的措施；其次要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無(wú)煙塵，不受日光直射，大小適當(dāng)，高度適宜；再次要求相對(duì)封閉，設(shè)有緩沖間，對(duì)無(wú)菌室每天用一定比例的消毒液進(jìn)行定期清掃和拖洗；最后室內(nèi)不易放置太多與細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)關(guān)的雜物，要時(shí)刻保持室內(nèi)干燥，有利于降低因環(huán)境因素引起的細(xì)胞污染概率。

紫外消毒是避免細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中因環(huán)境引起細(xì)胞污染的主要措施[6]，超凈工作臺(tái)應(yīng)放置在無(wú)菌室內(nèi)，每次使用前先開(kāi)啟紫外燈滅菌30 min，同時(shí)啟動(dòng)風(fēng)機(jī)凈化30min后再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)等一系列操作。操作結(jié)束后用75%酒精棉將臺(tái)面擦拭干凈，再用紫外燈照射30 min殺菌。超凈工作臺(tái)在長(zhǎng)期使用過(guò)程中可能會(huì)因灰塵積結(jié)過(guò)多而阻塞空氣過(guò)濾器，因此使用過(guò)程中應(yīng)時(shí)刻觀察臺(tái)內(nèi)氣流，若氣流變?nèi)?，酒精燈火焰幾乎不?dòng)時(shí)，應(yīng)及時(shí)檢測(cè)風(fēng)速、清洗或更換濾板。

3.1.3 操作人員污染的控制 操作人員在進(jìn)入無(wú)菌室前，須用肥皂洗手，按規(guī)定穿隔離衣，在緩沖間換穿專(zhuān)用服裝和拖鞋，進(jìn)出無(wú)菌間門(mén)口需用消毒劑洗手，操作開(kāi)始首先采用75%酒精棉球擦拭手雙手及瓶口。操作時(shí)動(dòng)作保持輕柔，盡量不談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。經(jīng)常更換吸管，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸手或其他物品外壁時(shí)均應(yīng)及時(shí)棄去更換一支。嚴(yán)禁在試驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中頻繁出入無(wú)菌室，試驗(yàn)完畢用消毒水浸泡的紗布擦拭臺(tái)面，將試驗(yàn)產(chǎn)生的固體垃圾和廢液等分類(lèi)歸置后及時(shí)清理出無(wú)菌室，在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分開(kāi)。操作人員的無(wú)菌意識(shí)是生產(chǎn)操作中的重中之重，一名有良好無(wú)菌意識(shí)的操作人員對(duì)大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的穩(wěn)定性有著重要意義。

3.1.4 交叉污染的控制 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在同一個(gè)無(wú)菌室或超凈臺(tái)里最好不要同時(shí)操作兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞株。細(xì)胞間的交叉污染可使細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)活性發(fā)生改變，能否控制細(xì)胞間的交叉污染對(duì)細(xì)胞產(chǎn)能起著決定性作用[7]。所以，應(yīng)盡可能減少無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)放置的物品，而且培養(yǎng)試劑一定要分門(mén)別類(lèi)，如同一個(gè)無(wú)菌室不同操作者所使用的，如胰酶、培養(yǎng)液等，避免因?yàn)橐粋€(gè)操作者的失誤致使無(wú)菌間內(nèi)所有細(xì)胞發(fā)生污染。

3.1.5 內(nèi)源性污染 為了減少內(nèi)源性污染對(duì)規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)的影響，必須建立細(xì)胞種子庫(kù)。細(xì)胞種子庫(kù)分為主細(xì)胞庫(kù)（Master cell bank，MC）和工作細(xì)胞庫(kù)（Working cellbank，WC）。細(xì)胞庫(kù)保存的二倍體細(xì)胞要經(jīng)過(guò)細(xì)菌、霉菌、病毒、支原體、胞核學(xué)、細(xì)胞鑒定、致瘤致癌性及病毒培養(yǎng)適應(yīng)性等一系列的檢測(cè)和鑒定，確保細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞的純凈性，從而作為理想的細(xì)胞來(lái)源[8]。原代細(xì)胞可以采取次代培養(yǎng)的方式避免污染的發(fā)生，例如當(dāng)需要大量培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)才可從主細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇細(xì)胞來(lái)建立工作細(xì)胞庫(kù)，若試驗(yàn)或生產(chǎn)需要細(xì)胞時(shí)只要從工作細(xì)胞庫(kù)復(fù)蘇細(xì)胞即可，傳代次數(shù)不能超過(guò)最高限制代次。為了保證培養(yǎng)細(xì)胞系的完整性，細(xì)胞凍存時(shí)必須進(jìn)行其信息的登記，如每一個(gè)凍存標(biāo)本都應(yīng)明確記錄細(xì)胞的種類(lèi)、來(lái)源、代數(shù)、倍增時(shí)間、凍存日期以及有無(wú)細(xì)胞污染，有利于對(duì)細(xì)胞的遺傳及生理特性在常規(guī)傳代培養(yǎng)中因突變、污染及各種原因?qū)е碌母淖冞M(jìn)行分析。對(duì)于外來(lái)的細(xì)胞系的選擇，應(yīng)保證其來(lái)源、品種明確、遺傳性穩(wěn)定、生產(chǎn)性能較佳[9]。

4 總結(jié)和展望

在規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)中，造成細(xì)胞污染的原因各異，控制細(xì)胞污染舉措的多樣。本文較系統(tǒng)地闡述了規(guī)?；a(chǎn)中細(xì)胞培養(yǎng)污染的來(lái)源、種類(lèi)以及防治各種污染的舉措三個(gè)方面，列舉了生產(chǎn)中經(jīng)常遇到的情況。實(shí)踐表明在生產(chǎn)過(guò)程中只要嚴(yán)格按照獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）操作，注意每一個(gè)操作環(huán)節(jié)，加強(qiáng)無(wú)菌意識(shí)的防范，就能有效地減少和控制污染、降低損失，提高生物制品的質(zhì)量，為順利生產(chǎn)及試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

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（編輯：高真貞）

Q813.1+1

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1006-799X(2016)19-0027-04

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201303046-05）

安芳蘭（1979-），女，甘肅秦安人，助理研究員，主要從事疫苗生產(chǎn)管理及工藝研發(fā)。

殷 宏（1966-），男，甘肅隴西人，研究員，主要從事對(duì)黃牛、牦牛、綿羊和山羊等反芻動(dòng)物危害嚴(yán)重的外寄生

蟲(chóng)及其傳播疫病的病原特性、流行病學(xué)、診斷及防治等方面的研究。