李　紅，易建中，劉成倩，孫曉云，嚴(yán)華祥**

?

簡述溶菌酶的研究現(xiàn)狀

李紅1，2*，易建中1，劉成倩1，孫曉云3，嚴(yán)華祥1**

（1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 閔行201106；2. 上海佳牧生物制品有限公司，上海 閔行201106；3. 上海海洋大學(xué)，上海 浦東新區(qū)201306）

摘要：溶菌酶（lysozyme）又稱胞壁質(zhì)酶，是一種普遍存在于植物、動物和微生物中的鹽基水解蛋白。溶菌酶的特征在于無毒、無害、無殘留、安全性高，因此被廣泛用于抗菌、抗炎、抗病毒、免疫力提升、促進(jìn)有益菌增殖（雙歧桿菌）等用途。本文分析和歸納了溶菌酶的研究發(fā)展、活性影響因素和分類，并總結(jié)了其在食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)和酶工程等行業(yè)的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：溶菌酶；性質(zhì)；分類；應(yīng)用

1　溶菌酶簡介

溶菌酶（Lysozyme，LYZ），又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase），其化學(xué)名稱為N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一種穩(wěn)定的堿性蛋白酶。它可對細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺、以及N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵進(jìn)行水解，促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，降低細(xì)菌細(xì)胞壁的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞壁裂解內(nèi)容物溢出，并最終引起細(xì)菌溶解［1］。在與帶負(fù)電荷的病毒蛋白相互結(jié)合的情況下，溶菌酶能夠與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽。這種復(fù)鹽具有使病毒失去活力的特性。研究表明，溶菌酶能夠在不破壞其他組織的前提下，有選擇地對微生物的細(xì)胞壁進(jìn)行分解。這種特性就使得溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)雙歧桿菌等有益菌增殖的獨(dú)特功效［2-4］。

據(jù)研究，溶菌酶作為單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的產(chǎn)物，對革蘭氏陽性菌有顯著的抑菌效果。而且，溶菌酶作為堿性蛋白酶，是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子，在抑殺病原體時(shí)不易產(chǎn)生抗藥性。溶菌酶的這種與抗生素不同的抑菌機(jī)制已經(jīng)得到重視，并應(yīng)用于食品級藥品當(dāng)中。另外，有文獻(xiàn)證明溶菌酶可作為免疫調(diào)節(jié)和免疫激活劑［5］，在免疫系統(tǒng)中起著重要作用。

溶菌酶的研究先驅(qū)者是歐洲學(xué)者Nicolle，他早在1907年就對枯草芽孢桿菌中的溶解因子（lytic factor）進(jìn)行研究。接下來在1922年，F(xiàn)leming等首次在人類的眼淚、唾液中發(fā)現(xiàn)溶菌酶。由于此酶具有溶解細(xì)胞壁殺死細(xì)菌的特征，因此Fleming將其命名為“溶菌酶”［6］。學(xué)者Robinson等在1937年從卵蛋白中首次分離出溶菌酶晶體，為進(jìn)一步揭示溶菌酶的內(nèi)在構(gòu)造奠定基礎(chǔ)，這揭開了溶菌酶研究的新篇章。1965年英國學(xué)者Blake等人使用X衍射法對存在于雞蛋蛋清中的溶菌酶進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)分析，徹底揭示出溶菌酶的立體結(jié)構(gòu)［7］。

研究表明，溶菌酶廣泛存在于四類生物組織：第一，高等動物的組織器官，如肝、腎、淋巴結(jié)、腸道等；第二，高等動物的分泌物，如家禽、鳥類的蛋清和哺乳動物的眼淚、乳汁、唾液、血液、鼻黏液、尿液。第三，部分植物體內(nèi)，如木瓜、卷心菜、白蘿卜、大麥、蕪菁和無花果等；第四，一部分微生物體內(nèi)?？茖W(xué)家還發(fā)現(xiàn)，雞蛋蛋清是自然界中溶菌酶含量最為豐富的生物組織［8］，溶菌酶的含量高達(dá)3.4 %～3.5 %［9］。目前，雞蛋已經(jīng)成為提取溶菌酶的首選和最佳來源。雞蛋蛋清溶菌酶也成為人們了解和研究最為透徹的一種溶菌酶形態(tài)。

雞蛋蛋清溶菌酶的分子量為14 000，一級結(jié)構(gòu)由129個氨基酸組成，其穩(wěn)定性主要與多級結(jié)構(gòu)中的4個二硫鍵、氫鍵及疏水鍵有關(guān)［10］，而且通過肽鍵上的Glu35和Asp52構(gòu)成的活性部位水解破壞組成微生物細(xì)胞壁的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸間的β-1，4糖苷鍵，使革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁溶解而殺死細(xì)菌的目的［11］。另外，人溶菌酶一級氨基酸結(jié)構(gòu)不同于蛋清溶菌酶，其分子量為14 600，由130個氨基酸組成，其中含有4個S-S鍵，但它們?nèi)壗Y(jié)構(gòu)有相似性。人溶菌酶活性比雞蛋清溶菌酶活性高2倍。目前實(shí)驗(yàn)已經(jīng)從哺乳動物如牛、馬、羊、豬、兔、猴等動物的乳汁中分離出溶菌酶，其化學(xué)性質(zhì)相似于人溶菌酶，但活性低于人溶菌酶，結(jié)構(gòu)現(xiàn)在還不清楚［12］。

目前工業(yè)提取溶菌酶的方法多種多樣，傳統(tǒng)的如結(jié)晶法；目前常用的有離子交換層析法；親和層析法；超濾法等［13］。溶菌酶在工業(yè)應(yīng)用上的使用大致包括如下幾個方面：第一，測定禽類機(jī)體非特異性免疫功能的的指標(biāo)。盡管溶菌酶在禽類體內(nèi)的作用尚未完全被揭示，但是一般認(rèn)為，禽類血清、體液和分泌物中溶菌酶的含量與機(jī)體防御功能密切相關(guān)。因此，測定禽類血清、體液和分泌物中溶菌酶的含量及其變動情況，可以成為評價(jià)機(jī)體非特異性免疫功能的有力依據(jù)［14］。

2　影響溶菌酶活性的因素

溶菌酶的使用需要充分地掌握溶菌酶的酶學(xué)特性，因?yàn)槊恳环N溶菌酶的最適反應(yīng)條件各有差異。為了測定不同因素對蛋清溶菌酶活性的影響，劉慧等［15］選擇了不同的因素（pH，溫度）和輔料（金屬離子和助溶劑）進(jìn)行研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋清溶菌酶在pH 6.0～6.5活性最強(qiáng)，pH 5.0～7.0范圍內(nèi)酶活性相對比較穩(wěn)定，pH大于7時(shí)溶菌酶活性下降急??；溫度為65 ℃時(shí)酶活性最強(qiáng)，在25 ℃～65 ℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高酶活性增強(qiáng)，但高于65 ℃則變性失活。另外，對溶菌酶活性產(chǎn)生輕微激活作用的有金屬離子K+、Na+；而對酶活性不產(chǎn)生明顯影響的則有Mn2+、Mg2+；讓酶活性產(chǎn)生降低的則有Cu2+、Fe2+、Zn2+、Co2+、Ca2+。研究還發(fā)現(xiàn)，吐溫80、吐溫20、甘油溶液對酶活性有抑制作用；EDTA-2Na在0.000 5 %～0.300 0 %濃度范圍內(nèi)對酶活性有激活作用，濃度繼續(xù)增加反而有抑制活性作用。

3　溶菌酶的分類

溶菌酶具有很強(qiáng)的底物特異性，不同來源的溶菌酶其作用底物也有所差異。根據(jù)來源的不同，溶菌酶可分為動物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和噬菌體溶菌酶。其中，動物源溶菌酶是數(shù)量、種類最多、分布最廣的一種，包括c型（chickentype）、g型（goose-type）和i型（invertebrate-type） 溶菌酶。動物源溶菌酶從節(jié)肢動物［16］、環(huán)節(jié)動物［17］、軟體動物［18-20］到鳥類［21-23］以及哺乳動物（牛）［24-26］，研究人員分別對其進(jìn)行了不同程度的研究。

根據(jù)溶菌酶作用細(xì)胞壁的不同，溶菌酶可分為細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶、真菌細(xì)胞壁溶菌酶［9］。根據(jù)作用位點(diǎn)的不同，溶菌酶可分為β-1，4糖苷鍵的細(xì)胞壁溶菌酶、肽鏈“尾”端和酰胺部分的細(xì)胞壁溶菌酶。又細(xì)分為酵母菌細(xì)胞壁溶菌酶、霉菌細(xì)胞壁溶菌酶。

目前主要分為7種：（1）內(nèi)N-乙酰己糖胺酶，與雞蛋清中溶菌酶相同，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵；（2）酰胺酶，切斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽“尾”與肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺之間的N-乙酰胞壁酸-L丙氨酸鍵；（3）內(nèi)肽酶，切斷肽“橋”與肽“尾”內(nèi)的肽鍵。（4）β-1，3、β-1，6葡聚糖和甘露聚糖酶，此酶降解酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁；（5）殼多糖酶，與葡聚糖酶共同作用分解霉菌細(xì)胞壁［27］；（6）磷酸甘露糖酶，與葡甘露糖酶共同作用，分解原生質(zhì)；（7）脫乙酰殼多糖酶，主要作用于毛霉和根酶。

4　溶菌酶的主要應(yīng)用

4.1溶菌酶在食品上的應(yīng)用

目前，溶菌酶在紅腸、香腸等肉類制品以及魚丸等水產(chǎn)類熟制品的制作過程中常常被用作防腐劑。馬美湖等人［28］比較了冷卻肉生產(chǎn)中溶菌酶、Nisin、Gna液的保鮮效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶菌酶、Nisin、Gna液分別單獨(dú)使用時(shí)，溶菌酶極明顯優(yōu)于對照組，略好于Nisin組，顯著好于Gna組。

另外，溶菌酶還被用于低溫肉制品的保鮮。如低溫保鮮劑Hnsafely-010（溶菌酶制劑）可以耐受低于95 ℃的溫度，而不影響其性質(zhì)，與低溫肉制品保鮮期相比，Hnsafely-010保鮮劑可以延長保鮮期一倍以上的時(shí)間。一些海鮮產(chǎn)品和水產(chǎn)品在0.05 %溶菌酶和3 %的食品溶液中浸漬5 min后，低溫、常溫保藏時(shí)間都得到延長［9］。

在奶制品中，人乳的最高溶菌酶含量，為山羊乳的1 600倍，牛乳的3 000倍［29］。溶菌酶是一種嬰兒生長發(fā)育不可或缺的抗菌蛋白。溶菌酶便于胃腸內(nèi)乳酪蛋白形成微細(xì)凝乳，利于嬰兒消化吸收；可以促進(jìn)人工喂養(yǎng)嬰兒腸道細(xì)菌群的正?；?；能夠加強(qiáng)體內(nèi)防御因子，增加對感染的抵抗力，對早產(chǎn)嬰兒在預(yù)防體重減輕方面有特點(diǎn)明顯的功效。值得一提的是，在人工喂養(yǎng)或食用母乳不足的情況下，溶菌酶添加到嬰兒食品中能夠有效抑制腸道中腐敗微生物的生存，并且還可以促進(jìn)腸道中雙歧桿菌的增殖。因此，溶菌酶是嬰兒食品、嬰兒配方奶粉等的良好添加劑。

另外，溶菌酶具有一般防腐劑不能達(dá)到的特性就是它不僅促進(jìn)乳酸菌生長，而且還能抑制污染菌引起的酪酸發(fā)酵。因此，添加到奶酪中的溶菌酶可以防止奶酪的后期起泡，以及奶酪風(fēng)味變化。溶菌酶作為防腐劑可用于巴氏殺菌奶，對奶的保質(zhì)期有明顯的延長作用，由于其具有一定的耐高溫特性，也適用于超高溫瞬時(shí)殺菌奶［28］。糕點(diǎn)中的奶油使糕點(diǎn)容易腐敗，如果在糕點(diǎn)中加入溶菌酶作為防腐劑，可防止糕點(diǎn)中微生物的增殖［30］。

由于蛋清中溶菌酶含量與酶活力呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系，因此蛋清中溶菌酶越高，越有利于雞蛋的保存。鑒于這種特性，雞蛋蛋清中的溶菌酶對我國禽蛋產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)具有重要意義［31］。

4.2溶菌酶在醫(yī)學(xué)和體育上的應(yīng)用

溶菌酶能夠參與粘多糖代謝，可作為對抗微生物感染的酶類抗菌藥。在內(nèi)服和外用藥配合使用下，溶菌酶對急性炎癥如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等療效明顯，對慢性鼻炎、慢性咽喉炎及扁平疣等也有輔助治療的作用。另外，將溶菌酶與抗生素合用還有助于預(yù)防齲齒。實(shí)驗(yàn)證明，用含溶菌酶的漱口液漱口或口含含有溶菌酶的口腔藥片，可以讓口腔內(nèi)細(xì)菌顯著地減少［32］。在環(huán)境衛(wèi)生學(xué)中，測定唾液中的溶菌酶活性是一個常用的非特異性免疫指標(biāo)，可以被用于檢測毒物對機(jī)體免疫功能的影響。溶菌酶甚至還被用于診斷白血病［33］。含有溶菌酶的潤喉液，眼藥水還可以用于抑制流行性感冒和腺病毒，具有抗感染及抗炎癥的功效。溶菌酶的溶菌作用也可以針對耐藥性細(xì)菌，并對人體具有極弱的副作用。有鑒于此，溶菌酶成為頗受青睞的藥用酶。

在體育領(lǐng)域，溶菌酶被用于評定運(yùn)動員的身體機(jī)能。溶菌酶作為機(jī)體非特異性免疫因子，能反映機(jī)體的免疫能力，是一項(xiàng)較靈敏的亞臨床指標(biāo)。因此，相對于身體狀態(tài)良好的運(yùn)動員，狀態(tài)不佳的運(yùn)動員具有較低的唾液溶菌酶滴定值。唾液溶菌酶的測定方法簡單易行，取樣方法也對人體不產(chǎn)生任何損傷。而且，這種方法有利于長時(shí)間追蹤觀察，因此被廣泛用于訓(xùn)練期和恢復(fù)期的機(jī)能評定。

4.3溶菌酶在飼料中的應(yīng)用

科學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溶菌酶具有替代抗生素的作用，能提升飼料的喂養(yǎng)效率、降低細(xì)菌的易感性和增加病原體脫落，最大限速地減少養(yǎng)豬生產(chǎn)損失。美國食品及藥物管理局為了限制飼料中的抗生素濫用，鼓勵溶菌酶在飼料領(lǐng)域的使用。美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究中心于2013年對溶菌酶影響動物生長性能的問題進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)豬飲食中添加溶菌酶可有效改善豬的生長性能。在實(shí)驗(yàn)中，豬在食用溶菌酶組或抗生素之后的生長速度大大提高，比食用未添加藥物的牛奶替代品的豬提高了12 %。另外，豬進(jìn)食含溶菌酶的流質(zhì)食物，可以有效改善小腸形態(tài)，從而降低彎曲桿菌胃腸道中的疾病發(fā)病率。王曉可等［34］發(fā)現(xiàn)溶菌酶使用于仔豬飼料中，可以降低料肉比和腹瀉率，提升豬的日增重和采食量，提高仔豬的健康水平。在不添加抗生素的情況下，雞飼料中添加溶菌酶還可以改善禽類生長性能［35］，提高血清中的溶菌酶含量和免疫功能，促進(jìn)更多的家禽抵御疾病侵害，更易成活和健康生長［36］。

4.4溶菌酶在科研上的應(yīng)用

溶菌酶是細(xì)胞工程和基因工程的一種不可或缺的工具酶。人們利用溶菌酶制造和提取菌體內(nèi)的活性物質(zhì)，例如酶、核酸和活性多肽等［37］。另外，溶菌酶具有專一性水解細(xì)胞壁的特征，有助于人們深入了解細(xì)胞壁的細(xì)微結(jié)構(gòu)。因此在生物技術(shù)、生物工程中，溶菌酶作為破壁酶，在微生物育種以及微生物分類等學(xué)術(shù)研究中被作為專用試劑。

近年來，人們還進(jìn)行了如下的新嘗試：第一，將溶菌酶固化在食品包裝材料上，以此生產(chǎn)出抗菌、保鮮功效的食品包裝材料。第二，將溶菌酶固化在空氣過濾器上，使其發(fā)揮出除塵和高效殺菌兩大作用［38］。第三，利用溶菌酶可降解海洋生物高分子殼聚糖的特性，生產(chǎn)能被人體吸收，具有低分子量，具有獨(dú)特生理活性和功能性質(zhì)的低聚殼聚糖［39］。

5　小結(jié)

溶菌酶是一種絕佳的天然蛋白質(zhì)，兼具防腐、保健和藥理三種功能，既對人體沒有毒性，也不會殘存于人體，還能在胃腸內(nèi)被消化和吸收。因此，溶菌酶作為安全性很高的食品保鮮劑、營養(yǎng)保健品和藥品，已經(jīng)被用在飲料或加工食品中。在倡導(dǎo)綠色、環(huán)保、健康的今天，人們對食品和醫(yī)藥的安全性要求越來越高，溶菌酶作為一種替代抗生素、傳統(tǒng)防腐劑的優(yōu)良產(chǎn)品，具有安全、高效、具有天然活性成分的優(yōu)勢，因此其應(yīng)用前景令人樂觀。不過，為了進(jìn)一步掌握每一類溶菌酶及其最適的反應(yīng)條件，弄清溶菌酶的酶學(xué)特性，需要探究水分、離子強(qiáng)度、pH等因素對酶活性的影響，促使酶活力得到最大程度的發(fā)揮。在食品行業(yè)，還需要進(jìn)一步弄清產(chǎn)生食品腐敗的微生物種類，以及研究如何增強(qiáng)溶菌酶對革蘭氏陰性細(xì)菌的溶菌作用，以便促進(jìn)溶菌酶的溶菌防腐功效。

參考文獻(xiàn)：（39篇，略）

中圖分類號：S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-0769（2016）06-0099-03

收稿日期：2016-04-01.

基金項(xiàng)目：蛋雞LYZC基因SNPs與雞蛋內(nèi)毒素含量的關(guān)聯(lián)研究（14YF1414600）。

*作者簡介：李紅（1983-），女，助理研究員，博士，主要從事動物分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究，Tel：021-62204612，E-mail：lihong20061029@163.com。

**通信作者：嚴(yán)華祥（1966- ），男，研究員，研究方向：蛋雞育種與雞蛋安全，電話：021-62205472，E-mail：yansafety@qq.com。