劉容枝 綜述，李耀華 審校

(國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京 100044)

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·綜述·

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑相關(guān)審評要點(diǎn)

劉容枝 綜述，李耀華△審校

(國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京 100044)

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；耐藥基因突變；企業(yè)參考品；分析性能評估

結(jié)核病是當(dāng)前危及人類生命的主要?dú)⑹?。?jù)世界衛(wèi)生組織估計，2012年全球約有45萬耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者，17萬人死于MDR-TB，全球1/4的MDR-TB患者在中國[1-3]。鑒于全球耐藥結(jié)核病的嚴(yán)峻形式，世界衛(wèi)生組織于2014年推出了《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊》(下稱《手冊》)，旨在指導(dǎo)耐藥結(jié)核病的預(yù)防、診斷和治療[4-5]。耐藥結(jié)核病是指由耐藥結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群引起的結(jié)核病。實驗室藥敏試驗是確診耐藥結(jié)核病的唯一方法。但是，傳統(tǒng)的實驗室藥敏試驗周期過長，容易延誤治療。基因型DST(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑)采用分子生物學(xué)方法檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因組中與特定耐藥相關(guān)的突變，可以快速鑒定是否存在耐藥相關(guān)的突變或耐藥，一般在24 h內(nèi)就可出結(jié)果，可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)藥敏試驗周期長的缺陷[6-8]。迄今為止，國內(nèi)外已有多種結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑獲準(zhǔn)上市。為了規(guī)范和指導(dǎo)此類試劑的注冊申報，下面總結(jié)了此類試劑申報中兩項重要的技術(shù)性文件(企業(yè)參考品和分析性能評估資料)的審評要點(diǎn)。

1　企業(yè)參考品

企業(yè)參考品主要包括陽性參考品、陰性參考品、最低檢測限參考品和精密度參考品[9-11]。申請人應(yīng)詳細(xì)說明企業(yè)參考品中每種菌株/核酸的來源、突變類型、濃度和制備方法等信息。

1.1陽性參考品申報產(chǎn)品可檢測的所有突變類型均應(yīng)設(shè)置不同濃度的陽性參考品。陽性參考品的突變類型應(yīng)經(jīng)過測序方法或已上市同類分型試劑的確認(rèn)。常見突變類型(建議申請人根據(jù)權(quán)威機(jī)構(gòu)的文件確定其代表性)的陽性參考品需采用菌株，其他突變類型的陽性參考品可采用結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株基因組或突變質(zhì)粒，不建議采用臨床樣本作為陽性參考品。

1.2陰性參考品可采用經(jīng)確認(rèn)靶序列未發(fā)生突變的結(jié)核分枝桿菌菌株等作為陰性參考品。

1.3最低檢測限參考品最低檢測限參考品應(yīng)包括聲稱的所有突變類型。常見突變類型的最低檢測限參考品應(yīng)采用菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸。

1.4精密度參考品精密度參考品至少應(yīng)包括陰性、弱陽性和中陽性3個水平。中陽性參考品可不包括所有突變類型，以常見突變類型為主，但弱陽性參考品必須包括所有突變類型。常見突變類型的精密性參考品應(yīng)采用菌株，其他突變類型可采用核酸。

2　分析性能評估資料

申請人應(yīng)提交采用申報產(chǎn)品進(jìn)行的所有分析性能評估資料，包括具體的試驗方法、試驗結(jié)果、統(tǒng)計分析以及接受標(biāo)準(zhǔn)等詳細(xì)資料。該類產(chǎn)品建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究[12-17]。

2.1陽性/陰性參考品符合率申報產(chǎn)品聲稱的所有突變類型的陽性參考品均應(yīng)檢出陽性，陰性參考品應(yīng)檢出陰性。

2.2最低檢測限建議采用95%(n≥20)的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)。擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的突變序列百分比和總核酸濃度2個因素對最低檢測限的影響較大，終體系中突變序列的百分比越高、所含核酸的數(shù)量越多，則突變越容易被檢出。而終體系中的這2個因素是由臨床樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥菌與野生菌的含量和相對比例決定的。因此，需從以下兩個方面考察申報產(chǎn)品的最低檢測限。

2.2.1100%耐藥比例下耐藥菌株/突變核酸的最低檢測濃度對于常見突變類型，將結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株進(jìn)行系列稀釋，制備不同濃度的耐藥菌株樣本。對于其他突變類型，可將突變質(zhì)?；蚪Y(jié)核分枝桿菌耐藥菌株基因組DNA進(jìn)行系列稀釋，制備不同濃度的核酸樣本。分別對各濃度樣本進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出時的濃度，即可作為可檢測的最低耐藥菌株/核酸濃度。

2.2.2不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測限配制不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的混合液：對于常見突變類型，將不同濃度的結(jié)核分枝桿菌野生菌株和耐藥菌株進(jìn)行混合，調(diào)整野生菌株和耐藥菌株的比例，得到含不同菌株濃度、各種耐藥比例的菌株混合液。對于其他突變類型，將不同濃度的野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒進(jìn)行混合，調(diào)整野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒的比例，得到含不同核酸濃度、各種耐藥比例的核酸混合液。對各份混合液進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出時的濃度，即可作為可檢測的最低菌株/核酸濃度以及耐藥比例。

3　分析特異性

3.1野生型菌株的交叉反應(yīng)采用不同濃度的結(jié)核分枝桿菌野生菌株進(jìn)行驗證，結(jié)果為陰性。

3.2申報產(chǎn)品聲稱的全部突變類型間的交叉反應(yīng)采用已知突變類型的耐藥菌株或核酸，驗證突變類型間的交叉反應(yīng)，非目標(biāo)突變類型的檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。

3.3核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體的交叉反應(yīng)鑒于臨床樣本中可能同時含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌以及其他病原體，因此，為了證明申報產(chǎn)品檢出的陽性結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變，而非其他分枝桿菌或病原體造成的假陽性結(jié)果，應(yīng)對核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證。用于交叉反應(yīng)研究的其他分枝桿菌和病原體主要包括：堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、龜分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、次要分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、胃分枝桿菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌等。

4　干擾物質(zhì)

4.1潛在干擾物質(zhì)主要包括內(nèi)源性物質(zhì)和外源性藥物。建議使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(最差條件)下進(jìn)行評價。對于內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，建議申請人選擇結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陰性的臨床樣本(該臨床樣本含有所有內(nèi)源性干擾基質(zhì)，比如：對于痰液樣本，含有粘液、血液等)作為內(nèi)源性干擾樣本，采用申報產(chǎn)品對該臨床樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果應(yīng)為陰性。用于干擾研究的外源性藥物主要包括：異煙肼、乙胺丁醇、利福平和吡嗪酰胺等。

4.2培養(yǎng)物樣本的干擾對于培養(yǎng)物樣本，干擾物質(zhì)主要為適用培養(yǎng)基的干擾，應(yīng)在最低檢測限濃度/陰性樣本條件下驗證適用培養(yǎng)基對檢測結(jié)果的影響，明確適用培養(yǎng)基是否對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。

5　精密度

精密度的評價方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，在保證科學(xué)合理的前提下，申請人可根據(jù)產(chǎn)品的特征或研究習(xí)慣自行選擇。具體試驗方法可參考國內(nèi)外的相關(guān)文件。申報產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下內(nèi)容。

5.1設(shè)立合理的精密度評價周期例如：連續(xù)檢測20 d，每天至少由2人完成不少于2次檢測，以便對批內(nèi)/批間以及日內(nèi)/日間等精密度進(jìn)行綜合評價。

5.2陰性樣本采用靶序列未發(fā)生突變的結(jié)核分枝桿菌野生菌株進(jìn)行試驗，陰性檢出率為100%(n≥20)。

5.3弱陽性樣本采用結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株或突變核酸進(jìn)行試驗，耐藥菌株或核酸濃度略高于申報產(chǎn)品的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)高于95%(n≥20)，弱陽性樣本應(yīng)包括申報產(chǎn)品聲稱的所有突變類型。常見突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本。

5.4中等陽性樣本采用結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株或突變核酸進(jìn)行試驗，耐藥菌株或核酸濃度約為最低檢測限的2或3倍，陽性檢出率為100%(n≥20)，可選擇申報產(chǎn)品聲稱的部分突變類型進(jìn)行驗證，但至少應(yīng)包括1株結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株。

6　不同樣本前處理方法和核酸提取純化方法的分析性能要求

該類產(chǎn)品所用臨床樣本(如：呼吸道樣本)的基質(zhì)比較復(fù)雜，臨床使用前常需進(jìn)行樣本前處理，并且臨床常用的前處理方法也不止1種。如果申報產(chǎn)品聲稱某種適用的臨床樣本類型可采用幾種方法進(jìn)行樣本前處理，申請人應(yīng)提交采用聲稱的樣本前處理方法與申報產(chǎn)品配合進(jìn)行的分析性能研究資料，試驗項目至少應(yīng)包括最低檢測限。

根據(jù)法規(guī)要求，核酸提取純化試劑按照Ⅰ類體外診斷試劑進(jìn)行管理，產(chǎn)品注冊相對容易，這促進(jìn)了核酸提取純化試劑在體外診斷試劑中的應(yīng)用。鑒于該類產(chǎn)品所用臨床樣本較為復(fù)雜，申請人常采用幾種市售的核酸提取純化試劑作為申報產(chǎn)品的配套試劑。如果申報產(chǎn)品聲稱某種臨床樣本類型可采用幾種方法進(jìn)行核酸提取純化，申請人應(yīng)提交采用聲稱的核酸提取純化方法與申報產(chǎn)品配合進(jìn)行的分析性能研究資料，試驗項目至少應(yīng)包括最低檢測限和精密度。

7　其他需要注意的問題

如果申報產(chǎn)品同時適用于幾種機(jī)型，應(yīng)提交采用所有適用機(jī)型進(jìn)行的全項目分析性能研究資料。如果申報產(chǎn)品包括多種包裝規(guī)格，申請人應(yīng)說明不同包裝規(guī)格的性能是否存在差異，如存在差異，應(yīng)提交不同包裝規(guī)格的全項目分析性能評估資料。

企業(yè)參考品在產(chǎn)品的設(shè)計開發(fā)、性能驗證和生產(chǎn)質(zhì)控等方面具有重要的作用。在產(chǎn)品設(shè)計研發(fā)的初期，申請人采用已上市同類產(chǎn)品或其他合理方法制備企業(yè)內(nèi)部參考品，然后采用企業(yè)內(nèi)部參考品選擇申報產(chǎn)品適用的主要原材料；在產(chǎn)品成型之后，申請人采用企業(yè)參考品對申報產(chǎn)品的分析性能進(jìn)行驗證；在每批產(chǎn)品出廠時，申請人采用企業(yè)參考品對生產(chǎn)的每批產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。分析性能評估資料對產(chǎn)品設(shè)計開發(fā)的結(jié)果進(jìn)行驗證，主要考察申報產(chǎn)品的最低檢測限、精密度、特異性等技術(shù)指標(biāo)。鑒于該兩部分資料在注冊申報中的重要性，希望申請人在法規(guī)框架下，依托企業(yè)自身的研發(fā)平臺和研發(fā)習(xí)慣，科學(xué)合理地制備企業(yè)參考品、進(jìn)行產(chǎn)品性能評價。

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,E-mail：liyh@cmde.org.cn。

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1673-4130(2016)18-2598-03

2016-04-03

2016-06-11)