何鳳屏，徐　新，吳青松，李定云，馬占忠，郭艷樂，唐　盛，尹衛(wèi)東，龔海濤，劉　藝，林恒先

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東汕頭 512026;2.廣東省深圳市邁科龍生物技術(shù)有限公司　518057)

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·論著·

量子點熒光標志結(jié)腸癌細胞及在其組織芯片的應(yīng)用價值*

何鳳屏1，徐新1，吳青松1，李定云1，馬占忠1，郭艷樂1，唐盛2，尹衛(wèi)東2，龔海濤2，劉藝2，林恒先2

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東汕頭 512026;2.廣東省深圳市邁科龍生物技術(shù)有限公司518057)

目的探討新的分子熒光標志量子點(QDs)在結(jié)腸癌組織芯片上進行不同蛋白的檢測及評價其臨床作用。方法在結(jié)腸癌組織芯片上，利用QDs標志的鏈霉親和素復(fù)合物(QDs-SA)能與生物素化二抗IgG熒光結(jié)合特點進行免疫熒光組織化學(xué)檢測K-ras、MXRA5蛋白表達，評價其在蛋白定位情況。結(jié)果觀察到K-ras、MXRA5蛋白在結(jié)直腸癌組織呈高表達，并定位于結(jié)腸癌細胞的細胞膜和胞核。結(jié)論QDs具有很好的熒光作用，能與抗體緊密結(jié)合。采用鏈霉親和素修飾的QDs，能夠準確地檢測結(jié)腸癌組織芯片上不同蛋白的定位,可為結(jié)腸癌體內(nèi)和體外臨床診斷提供新方法。

量子點熒光標志；結(jié)腸癌；K-ras蛋白；MXRA5蛋白

近年來，量子點由于其生物特性在體內(nèi)和體外的生物成像中優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，已受到人們的高度重視[1-2]。但是，目前在傳統(tǒng)的免疫熒光分析技術(shù)中，有機熒光標志是生物標志常用的探針，并在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。然而，有機熒光基團自身存在一些固有的缺陷，如熒光穩(wěn)定性差、易光漂白、發(fā)射譜峰拖尾等，這些都使其應(yīng)用受到限制。近年來，量子點在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用其熒光標志并取得令人滿意的效果[3-4]。本文將量子點的分子標志技術(shù)在結(jié)腸癌組織芯片上進行應(yīng)用，以及檢測K-ras、MXRA5的抗原結(jié)腸癌組織表達及分析,現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1結(jié)腸癌組織芯片相關(guān)資料2塊芯片為12×8點陣，每點直徑1.5 mm,4 μm厚，購自美國Pantomics公司。組織芯片內(nèi)包括60例結(jié)腸癌，7例結(jié)腸炎和5例健康人的結(jié)腸組織，每例組織均有2點。所有組織均來自臨床外科切除標本，經(jīng)10%中性緩沖甲醛固定24 h。其中男性34例，女性26例;腺癌55例，黏液癌5例。炎性病變7例，正常結(jié)腸組織5例。

1.2試劑鼠抗人K-ras、MXRA5單克隆抗體(即用型)和生物素化抗鼠IgG均購自上海一研生物科技有限公司。分子熒光標志量子點(QDs)標志的鏈霉親和素復(fù)合物(QDs-SA)檢測試劑盒購自武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限責任公司。

1.3QDs-SA檢測K-ras、MXRA5的蛋白表達根據(jù)試劑盒說明書進行操作。4 μm厚結(jié)腸癌組織芯片脫蠟、水化、微波抗原修復(fù)、TBS洗滌，封閉緩沖液37 ℃濕盒孵育30 min；滴加K-ras、MXRA5抗體，37 ℃孵育2 h，TBS-T漂洗3 min/次×3次，封閉緩沖液37 ℃濕盒孵育10 min；滴加生物素化抗鼠IgG，37 ℃濕盒孵育30 min，TBS-T漂洗3 min/次×3次，封閉緩沖液37 ℃濕盒孵育10 min；滴加用封閉緩沖液稀釋的QDs-SA(1∶100)37 ℃濕盒孵育60 min，TBS-T漂洗3 min/次×3次，滴加甘油封片。上熒光顯微鏡用不同波長激發(fā)QDs，以細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光顆粒為陽性，TBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，整個試驗過程均不需要避光。

2　結(jié)　　果

2.1QDs-SA檢測K-ras的蛋白表達在熒光顯微鏡下(紫外光激發(fā))均可以清楚地見到結(jié)腸組織中有QDs標志的部位發(fā)綠色熒光，顯示K-ras蛋白存在部位，背景很干凈，表明沒有非特異性結(jié)合。在正常結(jié)腸組織中K-ras蛋白存在于黏膜細胞，可見QDs標志的部位發(fā)綠色熒光；在結(jié)腸組織的癌細胞的胞膜內(nèi)有K-ras蛋白陽性表達,可見QDs標志的部位發(fā)紅色熒光；在結(jié)腸組織的腺瘤細胞的胞膜內(nèi)有K-ras蛋白陽性表達,可見QDs標志的部位發(fā)紫紅色熒光。

2.2QDs-SA檢測MXRA5的蛋白表達在熒光顯微鏡下(紫外光激發(fā))均可以清楚地見到結(jié)腸組織中有QDs標志的部位發(fā)綠色熒光，顯示MXRA5蛋白存在部位，背景很干凈，表明沒有非特異性結(jié)合。在熒光顯微鏡下可以清楚地看見在正常結(jié)腸組織中MXRA5蛋白存在于黏膜細胞，可見QDs標志的部位發(fā)綠色熒光；在結(jié)腸組織的癌細胞的胞膜內(nèi)有MXRA5蛋白陽性表達,可見QDs標志的部位發(fā)紅色熒光；在結(jié)腸組織的腺瘤細胞的胞膜內(nèi)有MXRA5蛋白陽性表達,可見QDs標志的部位發(fā)紫紅色熒光。

3　討　　論

量子點是一類直徑小于100 nm的半導(dǎo)體納米晶粒,是1種新型及很有潛力的熒光標志物。量子點標志探針廣泛應(yīng)用于腫瘤的體內(nèi)外研究,尤其是腫瘤靶向成像、前哨淋巴結(jié)成像、腫瘤示蹤、腫瘤細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)成像及腫瘤標志物檢測等。量子點納米標志熒光不僅能特異性靶向腫瘤部位，還能通過熒光強弱反映出其活躍程度，可應(yīng)用于腫瘤的早期診斷和監(jiān)測療效[1-4]。

QDs最顯著的光學(xué)特性是激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄而對稱、熒光壽命長、抗漂白能力強、stokes位移大、摩爾消光系數(shù)大。相對于傳統(tǒng)常用的有機熒光染料，QDs作為生物熒光標志具有如下的優(yōu)勢：(1)多色性，由于QDs的激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄而強，一個光源能同時激發(fā)不同熒光的QDs，所以可以選用不同粒徑或組成的QDs，實現(xiàn)多通路生物分子標志，且各種熒光標志之間相互干擾小。從本研究可以看出，紫外光、藍光激發(fā)在熒光顯微鏡下均可以清楚地見到結(jié)腸組織中有QDs標志的部位發(fā)綠色的光。此外，QDs的熒光發(fā)射光譜窄且對稱，光譜之間不重合或很少重合，用其做標志物可顯著提高分析方法的靈敏度和分辨率。QDs的發(fā)射光是有機熒光染料的20～100倍，穩(wěn)定性強100～1 000倍，可以經(jīng)受反復(fù)多次激發(fā)，不像有機熒光染料的熒光容易瘁滅[5]。(2)QDs的抗漂白能力強光穩(wěn)定性好，摩爾消光系數(shù)大，顯示出更高的熒光強度，可在活細胞內(nèi)態(tài)、實時示蹤分子轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。(3)背景干擾小，QDs的stokes位移大、熒光壽命長，從而使所發(fā)射的熒光能從背景熒光中脫穎而出。(4)生物相容性好：經(jīng)適當?shù)纳镄揎椇螅琎Ds生物相容性好，適于活體或細胞研究。同時，QDs與生物大分子的耦聯(lián)方法和方式比較簡單，例如化學(xué)鍵和靜電力進行耦聯(lián)等，而傳統(tǒng)標志試劑，每種試劑均需要特定的耦聯(lián)方法。本文采用鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)的非共價耦聯(lián)的方式結(jié)合，將生物素化抗體與鏈霉親和素標志QDs非共價耦聯(lián)。其特點是操作簡單易行，耦聯(lián)反應(yīng)的特異性強，耦聯(lián)效率高，產(chǎn)物的穩(wěn)定性好，可實現(xiàn)高靈敏度檢測[6-7]。

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢。早期診斷和治療是提高結(jié)直腸癌治愈率的關(guān)鍵。通過從分子水平對腫瘤標志物的高靈敏度檢測，有助于對腫瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷[6-8]。K-ras和MXRA5是在結(jié)直腸癌細胞表面表達的1種腫瘤相關(guān)抗原。有研究表明，K-ras和MXRA5是在結(jié)直腸癌組織呈高水平的表達，在正常組織表達很低或不表達，對其檢測有助于對結(jié)直腸癌的早期診斷[9-10]。本文將生物素化抗體與鏈霉親和素標志QDs非共價耦聯(lián)，成功制備可以特異性檢測結(jié)直腸癌細胞表面表達的QDs標志K-ras和QDs標志MXRA5的熒光探針，可以觀察到結(jié)腸癌細胞表面的熒光圖像。同時，免疫熒光標志也顯示，QDs非共價耦聯(lián)后，K-ras和MXRA5抗體仍具有與細胞表達的抗原特異結(jié)合的活性。結(jié)果表明，將QDs和單克隆抗體(K-ras、MXRA5)非共價耦聯(lián)后制備的熒光探針，能夠很好應(yīng)用于結(jié)腸癌細胞特異的免疫熒光成像分析。

Jaiswal等[11]比較早使用結(jié)合親和素的QDs標志腫瘤細胞。他們利用細胞攝取QDs和QDs結(jié)合抗體標志細胞表面蛋白來使活細胞成像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用殼-核型QDs標志多種細胞，可在長達12 d過程中不影響細胞的生長和發(fā)育，開創(chuàng)了簡單、易行的非基因工程方法來研究腫瘤細胞的生物學(xué)行為。目前，對腫瘤細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)成像，使用最多的方法仍以QDs標志抗體與腫瘤細胞表達的特異性抗原結(jié)合，如細胞結(jié)構(gòu)、腫瘤標志物、特殊受體等[12-13]。本文通過采用親和素修飾QDs，再把需要耦聯(lián)的抗體生物素化，QDs很容易與抗體結(jié)合，耦聯(lián)物可用于熒光免疫分析，與傳統(tǒng)的有機熒光標志試劑(即一抗或二抗)相比，在臨床上的應(yīng)用更廣闊。Jaiswal等[11]也有類似的報道。Jaiswal等[11]將生物素化的膜糖蛋白(P-gp)特異性抗體作為一抗，與親和素結(jié)合的QDs依次與細胞結(jié)合，實現(xiàn)了對P-gp轉(zhuǎn)染的宮頸癌HeLa細胞的表面標志，為活細胞成像研究提供了1種新方法。國外學(xué)者采用生物素-鏈霉親和素的方法將OD560、QD608、QD630標志的抗體檢測乳癌細胞株上Her2的表達情況，將乳癌細胞SK-BR-3細胞與Her2抗體孵育，此后，以QDs標志Her2抗體共孵育后成功在細胞表面標志出該腫瘤標志物Her2[14-15]。本文實現(xiàn)了結(jié)腸癌組織芯片上進行K-ras、MXRA5抗原的檢測，蛋白定位準確，背景很干凈，因此認為優(yōu)于免疫組織化學(xué)。此外，本方法結(jié)合分子生物學(xué)和細胞形態(tài)學(xué)原理，具有成本低、簡便快速、信息量大的特點，適合在各級醫(yī)院的應(yīng)用。

綜上所述，QDs在腫瘤標志物檢測中的應(yīng)用都是以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，QDs經(jīng)過標志后與抗體緊密結(jié)合應(yīng)用于臨床，已顯示出廣闊的應(yīng)用前景[16-17]。無論是體內(nèi)腫瘤靶向成像，還是體外細胞成像等研究，QDs熒光標志都是1個很好的工具。隨著QDs制備和標志技術(shù)的不斷提高，QDs對腫瘤診斷率和療效方面的貢獻就更大。通過QDs標志體系建立1個高特異性、高敏感性的腫瘤檢測平臺，是QDs在腫瘤學(xué)中應(yīng)用的1個重要方向。

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Application of quantum dots immune fluorescent labelling in colorectal cancer tissues*

HEFengping1,XUXin1,WUQingsong1,LIDingyun1,MAZhanzhong1,GUOYanle1,TANGSheng2,YINWeidong2,GONGHaitao2,LIUYi2,LINHengxian2

(1.AffiliatedYuebeiPeople′sHospitaloftheShantouUniversity,Yuebei,Guangdong512026,China;2.ShenzhenMicroprofitBiologicalTechnologyco.,LTD,Shengzhen,Guangdong518057,China)

ObjectiveTo investigate different antigens detected by a novel labelled reagent-quantum dots(QDs) in the colorectal cancer tissues microarray(TMA).MethodsDepend on QDs streptavidin conjugate(QDs-SA) combined specially with biotinylation IgG,immune of luorescent histochemistry was utilized to examine expression of K-ras，matrix-remodeling associated 5(MXRA5) proteins in the colorectal cancer TMA,where the protein accurate location was observed.ResultsK-ras，matrix-remodeling associated 5(MXRA5) proteins were high expressed in colorectal cancer tissue and located accurately in the cell membrane and nucleus of colorectal cancer cells,respectively.ConclusionQDs exhibit excellent photostability,broad emission spectrum and long fluorescence lifetime.Modified with streptavidin could accurately detect different protein locations in the colorectal cancer TMA.This is a novel approach for studying targeted imaging of colorectal cancer in vivo and vitro clinical diagnosis.

quantum dots fluorescent labelled;K-ras；MXRA5;colorectal cancer

廣東省重大科技專項基金資助項目(2013A022100011)。

何鳳屏，女，主任技師，主要從事腫瘤分子診斷的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.010

A

1673-4130(2016)18-2531-03

2016-04-19

2016-06-25)