曾藝鵬，胡凌紅 綜述，馮新格 審校

(上海市浦東醫(yī)院：1.中醫(yī)科；2.檢驗(yàn)科　201399)

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·綜述·

2型糖尿病患者腸道菌群特異性生物標(biāo)志物研究進(jìn)展*

曾藝鵬1，胡凌紅2綜述，馮新格1審校

(上海市浦東醫(yī)院：1.中醫(yī)科；2.檢驗(yàn)科201399)

2型糖尿?。荒c道菌群；生物標(biāo)志物

2型糖尿病(T2DM)是一種受遺傳和環(huán)境雙重影響的綜合性疾病，而后者被認(rèn)為是導(dǎo)致發(fā)病率增加的主要原因。近年來(lái)已有報(bào)道腸道菌群與肥胖存在關(guān)聯(lián)[1]，同時(shí)有諸多研究報(bào)道胰島素抵抗也是一種低級(jí)的炎性反應(yīng)[2]，而胃腸道菌群兼具基因及環(huán)境雙重因素。假設(shè)腸道菌群對(duì)宿主的肥胖表型、代謝及炎性狀況具有預(yù)測(cè)性意義，腸道菌群的分布、基因及代謝產(chǎn)物等可以作為研究人體代謝性疾病的生物性標(biāo)志物。

1　人體腸道菌群的組成

人腸道中至少存在1 014個(gè)微生物，這些微生物基因有數(shù)百個(gè)人類不具備的基因[3]。這樣一個(gè)復(fù)雜的腸道微生物群，主要由細(xì)菌組成，其中大部分不能培養(yǎng)。腸道菌群能增加能量吸收和儲(chǔ)存，增加酵解和吸收不消化的糖類[4]。同時(shí)腸道菌群參與免疫反應(yīng)維持腸道免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，如它們?cè)谀c道對(duì)T細(xì)胞亞群分化和B細(xì)胞分化成IgA分泌細(xì)胞起重要作用[5-6]。腸道菌群主要由3個(gè)門的細(xì)菌組成，分別是革蘭陽(yáng)性的厚壁菌門和放線菌門，以及革蘭陰性的擬桿菌門。目前主要通過(guò)16S rRNA技術(shù)進(jìn)行腸道菌群多樣性的分析，厚壁菌是最大的菌門，而放線菌門雖然也是一個(gè)主要的菌門，但是通過(guò)RNA測(cè)序通常被遺漏，只能通過(guò)熒光原位雜交檢測(cè)[7]。新生兒腸道菌群的建立起初是通過(guò)母親的產(chǎn)道或皮膚，腸道菌群一開始是定植的兼性需氧菌，隨后是厭氧菌。腸道菌群在組成上會(huì)保持一種相對(duì)的穩(wěn)定，直至老年，但是只有在許多變量保持不變的情況下才能保持暫時(shí)的穩(wěn)定。如飲食改變能明顯影響腸道菌群，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，老鼠從高脂肪、高糖飲食轉(zhuǎn)向低脂肪、富含植物多聚糖飲食，在24 h后就能改變腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)。一些研究甚至發(fā)現(xiàn)，環(huán)境與腸道菌群分布更密切，有時(shí)甚至超過(guò)基因遺傳。如，異卵雙胞胎和同卵雙胞胎的腸道菌群分布都相似[4]，不同小鼠共同生活后腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于相似[8]?？股氐氖褂檬歉淖兡c道菌群的另一個(gè)環(huán)境因素。一些研究顯示采用抗菌藥物治療后，導(dǎo)致腸道菌群大的改變。腸道抗細(xì)菌定植作用下降，使得一些外來(lái)菌生長(zhǎng)，可能導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期性改變，這種改變可能導(dǎo)致疾病。盡管這些改變的菌種存在個(gè)體差異，其中一些不能在治療后的數(shù)月內(nèi)恢復(fù)，事實(shí)上大多數(shù)個(gè)體存在菌種多樣性的下降。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，研究組小鼠經(jīng)低劑量的抗菌藥物治療后，會(huì)導(dǎo)致代謝活動(dòng)增加，消化復(fù)雜的糖類攝取更多卡路里[9]。這種方式也增加了代謝活動(dòng)的產(chǎn)物——短鏈脂肪酸的產(chǎn)量，同時(shí)伴隨增加了向肝臟門靜脈循環(huán)的輸出量，促進(jìn)了脂肪合成。

2　腸道菌群與肥胖、胰島素抵抗及T2DM的關(guān)系研究

生活方式的改變和高能量食物的攝取，無(wú)疑是世界范圍內(nèi)肥胖病流行的重要因素之一。同時(shí)，腸道內(nèi)菌群通過(guò)從食物中攝取能量對(duì)新陳代謝活動(dòng)也會(huì)產(chǎn)生影響。而后者被認(rèn)為是導(dǎo)致肥胖及肥胖并發(fā)癥(如胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病)的重要外界環(huán)境因素。腸道微生物移植入這些無(wú)菌小鼠體內(nèi)后，可以起到調(diào)節(jié)其骨質(zhì)密度、促進(jìn)脂肪的囤積、促進(jìn)腸血管生成及促進(jìn)免疫應(yīng)答發(fā)育的作用[10]。通過(guò)宏基因組學(xué)和無(wú)菌動(dòng)物模型等技術(shù)方法為研究腸道菌群在能量代謝中的作用及其與代謝性疾病之間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。

肥胖患者腸道內(nèi)的菌群組成會(huì)發(fā)生改變，并且可能隨著體質(zhì)量的變化而變化。在人類肥胖病患者的糞便排泄物中，相比對(duì)照，厚壁菌門細(xì)菌相對(duì)較多，而擬桿菌門細(xì)菌相對(duì)較少。通過(guò)限制脂肪或糖類的攝入，體質(zhì)量減少伴隨擬桿菌水平相應(yīng)提高[1]。在胃旁路手術(shù)后體質(zhì)量降低的肥胖患者身上也出現(xiàn)了類似的情況，這些患者體內(nèi)擬桿菌和普氏菌的數(shù)量與能量和脂肪的攝入量呈負(fù)相關(guān)[11]。但也有研究并未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，甚至有相反的結(jié)論，原因可能是因?yàn)槭褂昧瞬煌呐R床標(biāo)準(zhǔn)(如肥胖的程度、年齡、減肥的強(qiáng)度和熱量限制持續(xù)的時(shí)間)、地理位置、人口規(guī)模和微生物分析方法。盡管肥胖和能量攝取可以影響微生物菌群的組成比例，但是否會(huì)影響人類肥胖病的機(jī)制還不甚清楚。

胰島素是維持血糖動(dòng)態(tài)穩(wěn)定的主要激素，通過(guò)胰島素受體的自磷酸化激活其生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞因子和趨化因子分泌可能削弱胰島素信號(hào)通路，在T2DM患者中T細(xì)胞分泌更高的IL-17和IFN-γ，導(dǎo)致一種炎癥前狀態(tài)；其他一些細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6，都與胰島素抵抗相關(guān)。同時(shí)，體內(nèi)固有免疫也能影響胰島素抵抗，Toll樣受體起著重要作用。細(xì)菌脂多糖能激活Toll樣受體4，上調(diào)炎性表達(dá)水平，然后誘導(dǎo)胰島素抵抗。如果Toll樣受體4基因變異或被敲除，則可能防止胰島素抵抗[12]。高脂肪飲食可能會(huì)增加革蘭陰性菌/革蘭陽(yáng)性菌的比值，致血液脂多糖增加引起內(nèi)毒素血癥和代謝性疾病[13]。動(dòng)物試驗(yàn)中，對(duì)高脂肪飲食老鼠使用抗菌藥物能降低血液脂多糖濃度，能緩解糖尿病和肥胖癥的指征[14]。

最近有研究報(bào)道腸道菌群在T2DM的發(fā)展進(jìn)程中可能起著重要作用[15]，全基因組相關(guān)研究(GWAS)為我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)這一作用打開了一扇窗。研究人員對(duì)T2DM患者的腸道菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)糖膜運(yùn)輸、支鏈氨基酸運(yùn)輸、甲烷代謝、外源性化合物降解及硫酸鹽還原等作用增強(qiáng)；同時(shí)，他們也發(fā)現(xiàn)丁酸合成、細(xì)菌耐藥性、鞭毛組裝及維生素和輔酶代謝等作用下降[15]。該研究也發(fā)現(xiàn)T2DM患者的腸道環(huán)境刺激細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)氧應(yīng)急反應(yīng)和藥物的抵抗。

3　T2DM生物性標(biāo)志物的篩選與評(píng)估

3.1厚壁菌/擬桿菌比值分析腸道微生物群的組成在肥胖人群中有變化，而且它能應(yīng)對(duì)體質(zhì)量變化。有報(bào)道肥胖患者相比對(duì)照組，有著特殊的腸道菌群：少的擬桿菌，多的厚壁菌[1,4,7]。擬桿菌隨著體質(zhì)量的下降而增加，暗示擬桿菌可能會(huì)影響熱量的攝入[1]。另一研究發(fā)現(xiàn)胃旁路術(shù)導(dǎo)致體質(zhì)量減輕，對(duì)于肥胖人更是降低糖尿病及心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[11]， 在這些患者中擬桿菌和普雷沃菌水平升高與能量攝入和肥胖呈負(fù)相關(guān)[11]。 但是也有一些研究不認(rèn)為厚壁菌與擬桿菌的比例有轉(zhuǎn)換，也有報(bào)道指出擬桿菌下降，并非厚壁菌上升，而是放線菌上升[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Toll樣受體2敲除老鼠表現(xiàn)出厚壁菌相對(duì)性升高和稍微高的擬桿菌。但是，它們12周后體質(zhì)量增加，20周后變胖，提示腸道菌群的改變可以導(dǎo)致肥胖[16]。

Crohn 病研究發(fā)現(xiàn)患者在腸道菌群的整體多樣性有明顯下降，微生物的組成有明顯變化[1,10]，T2DM的厚壁菌門比例和梭菌屬比例有明顯下降[11]。擬桿菌門被認(rèn)為富含磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，參與糖類處理；厚壁菌門富含運(yùn)輸系統(tǒng)。其中有75%與肥胖相關(guān)的基因來(lái)自放線菌，25%來(lái)自厚壁菌；而42%與瘦相關(guān)基因來(lái)自擬桿菌。功能性分析提示它們中的許多參與糖類、脂質(zhì)和氨基酸代謝[4,16]。這些發(fā)現(xiàn)提示一個(gè)核心腸道菌群基因組的存在，影響代謝功能的改變，而不是簡(jiǎn)單的細(xì)菌群多樣性或相對(duì)豐度的變化[4]。

3.2腸道菌群腸型分析單純的去研究腸道微生物的不同組分而言，最近提出的腸型(Enterotypes)的研究似乎更有意義。2011年，《Nature》發(fā)表了一篇對(duì)腸道微生物分型研究的文章，研究者把腸道微生物群落分成了3個(gè)腸型[17]，該研究結(jié)果被《Science》雜志評(píng)為2011年十大科學(xué)突破之一。研究人員通過(guò)主成分分析根據(jù)腸道菌群中的主導(dǎo)微生物，將3個(gè)腸型分別稱其為腸型1(Enterotype 1)——擬桿菌型、腸型2(Enterotype 2)——普雷沃菌型和腸型3(Enterotype 3)——瘤胃球菌型。瘤胃球菌通常較難分離，部分會(huì)歸入擬桿菌型[18]。腸型的分類與人的年齡、體質(zhì)量、性別或國(guó)籍不相關(guān)，每一個(gè)腸型在如何處理能源、產(chǎn)生哪一種維生素、可能影響人類宿主健康的因素等方面有所不同。同時(shí)另一個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)，腸型似乎與飲食相關(guān)[18]。例如，肉類飲食使類桿菌屬細(xì)菌迅速繁殖；而素食則促進(jìn)普雷沃屬細(xì)菌迅速繁殖。這兩種腸型都不受10 d內(nèi)飲食限制的影響，表明他們受更長(zhǎng)期的飲食趨勢(shì)的影響。

由154名美國(guó)人[4]和85名丹麥人[19]組成的較大樣本的腸道微生物組研究也適合分成這3種腸型，這表明在人體腸道內(nèi)，菌群平衡的腸道菌類型的數(shù)量有限。然而有一篇報(bào)道不認(rèn)為T2DM與腸型存在必然聯(lián)系[20]，因此對(duì)腸型與疾病的關(guān)聯(lián)性還需要更多的工作去研究。

3.3細(xì)菌基因豐度的分析通過(guò)對(duì)肥胖和非肥胖人員腸道細(xì)菌基因豐度的分析發(fā)現(xiàn)，研究組和對(duì)照組有不同的基因數(shù)量，即豐度[21]，且這些人群中呈現(xiàn)明顯的雙峰分布。這些基因包括已知和未知菌種的基因，相比高細(xì)菌基因豐度的人群，一些具有低基因豐度的人群顯示出更突出的肥胖、胰島素抵抗、糖代謝紊亂等表型。Le等[21]對(duì)于大量腸道微生物基因(主要是細(xì)菌的基因豐度)在不肥胖和肥胖的個(gè)體丹麥人之間的差異進(jìn)行了描述。作者發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)以很小一部分細(xì)菌種屬的基因豐度為基礎(chǔ)從而得出整體上細(xì)菌基因豐度。其次，低細(xì)菌基因豐度的個(gè)體要比高細(xì)菌基因豐度的個(gè)體整體上具有更高水平的脂肪(即肥胖)，并伴有與炎癥相關(guān)的一些特性。他們還發(fā)現(xiàn)，在肥胖志愿者中，那些低細(xì)菌基因豐度的個(gè)體要比高基因豐度的個(gè)體更容易發(fā)胖，說(shuō)明他們具有與炎癥相關(guān)的腸道微生物群。

Cotillard等[22]證實(shí)在腸道低細(xì)菌基因豐度的肥胖和超重的人群中通過(guò)能量限制的飲食會(huì)產(chǎn)生微生物豐度的增高和炎癥減少的結(jié)果，但這種飲食干預(yù)的方法對(duì)于那些高基因豐度的人群則不起作用。這一結(jié)果說(shuō)明細(xì)菌種類基因豐度在特殊人群中存在差異性分布的特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)于個(gè)體對(duì)飲食干預(yù)的回應(yīng)能力具有預(yù)測(cè)性。這一概念的產(chǎn)生使臨床研究及藥物研發(fā)大有可為，因?yàn)樗鼮閭€(gè)體患者的藥物訂制和微生物生態(tài)的重新制定開啟了新的途徑。

3.4宏基因組基因關(guān)聯(lián)群組(MLG)及宏基因簇(MGCs)使用類似GWAS的方法發(fā)現(xiàn)都有哪些DNA組出現(xiàn)了問(wèn)題，再使用所謂的宏基因組關(guān)聯(lián)研究(MGWAS)確定T2DM患者和非T2DM患者體內(nèi)宏基因組之間的差異。通過(guò)這種MGWAS技術(shù)他們一共發(fā)現(xiàn)了4.2萬(wàn)多個(gè)與T2DM有關(guān)的基因標(biāo)志物，這可是一個(gè)天文數(shù)字，這么多信息在一時(shí)之間很難被徹底地消化和處理。所以為了簡(jiǎn)化問(wèn)題，消除不必要的冗余信息，研究者又設(shè)計(jì)了宏基因組基因關(guān)聯(lián)群組(MLG)[23]或是宏基因簇(MGCs)[24]的方法。

根據(jù)基因標(biāo)志物的相對(duì)豐度或者分類將T2DM患者和非T2DM患者體內(nèi)的宏基因組模式加以歸納和提煉，這樣就解決了當(dāng)前在宏基因組分析工作中出現(xiàn)的兩個(gè)最主要的問(wèn)題。第一個(gè)問(wèn)題就是到目前為止，我們?cè)谶M(jìn)行宏基因組分析工作中采用的分析方法一直都是將測(cè)序結(jié)果與現(xiàn)有的微生物參考序列進(jìn)行比對(duì)，再根據(jù)比對(duì)結(jié)果推測(cè)被測(cè)微生物組的微生物組成種類及其功能。但是有很多時(shí)候我們得到的測(cè)序結(jié)果在參考數(shù)據(jù)庫(kù)中根本就找不到與之匹配的參考微生物，比如被測(cè)的微生物是非常少見的微生物等，所以這些信息也就無(wú)法采用，也就不能真正確定被測(cè)微生物組到底由哪些微生物組成。不過(guò)有了MLG和MGCs方法之后，這些罕見的基因也都可以被納入規(guī)模更大的MLG[23]或MGCs[24]當(dāng)中，再也不會(huì)被漏掉了。第二個(gè)問(wèn)題就是單純采用分類法也會(huì)出現(xiàn)失誤，因?yàn)榛蛟谖⑸镏g是可以流動(dòng)的，而且微生物自身的基因也是會(huì)發(fā)生變異的，所以簡(jiǎn)單采用分類的方法進(jìn)行分析經(jīng)常會(huì)得到錯(cuò)誤的結(jié)果。

3.5特異性菌群研究發(fā)現(xiàn)如果人體內(nèi)缺少了一種產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌就容易患上T2DM[23]。丁酸鹽是一種可以被腸道細(xì)胞使用的能量分子，它也有助于減弱結(jié)腸炎性反應(yīng)。所以如果因?yàn)槿笔Мa(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌使得腸道內(nèi)的丁酸鹽含量降低，就會(huì)增加腸道內(nèi)的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致胰島素抵抗進(jìn)而患上T2DM。Qin等[23]還發(fā)現(xiàn)在T2DM患者的結(jié)腸內(nèi)有機(jī)會(huì)致病菌增多以及微生物基因組中耐氧化壓力基因增多的現(xiàn)象，這些情況也都有助于增加腸道內(nèi)的炎性反應(yīng)。

胃旁路術(shù)可能具備直接的抗糖尿病作用[25]，具體機(jī)制不明，除前面提到的這些人糞便中的微生物群組成發(fā)生了改變，提示胃旁路術(shù)后腸道菌群改善了患者的代謝表型。特別是一種有益的細(xì)菌——柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)在肥胖和糖尿病中低豐度，而在術(shù)后增加了。普拉梭菌是一種與炎性負(fù)相關(guān)的生物性標(biāo)志物，它可能參與調(diào)節(jié)肥胖和糖尿病中的系統(tǒng)性炎癥，而且能改善糖尿病。

攝食菊粉能增加柔嫩梭菌和雙歧桿菌水平。同樣在飲食誘導(dǎo)肥胖老鼠中，相比同樣高脂肪飲食老鼠而未投益生素，益生素能選擇性的增加雙歧桿菌屬，這種增加同時(shí)伴肥胖減輕、微生物源炎性分子水平(如脂多糖)降低[19]。人如果增加食用抗性淀粉，會(huì)增加糞便中布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii) 和直腸真桿菌(Eubacterium rectale)水平，它們與纖維素酵解相關(guān)[26]。消化抗性淀粉有助于提高胰島素敏感性[27]，但是不同個(gè)體間微生物應(yīng)對(duì)抗性淀粉有差異，因此需要個(gè)性化方案[26]。

肥胖更容易從食物中攝取能量，伴隨氫元素的轉(zhuǎn)移，與肥胖相關(guān)的產(chǎn)氫普氏菌和利用氫氣產(chǎn)甲烷古生菌同時(shí)增加[28]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，如果多行擬桿菌定植老鼠，同時(shí)定植史氏甲烷短桿菌會(huì)增加食物果聚糖酵解增加。多行擬桿菌制造更多的乙酸和甲酸鹽，而史氏甲烷短桿菌利用甲酸鹽生成甲烷。這種合作增加了糖類酵解，從腸道吸收更多的能量，相比單獨(dú)定植多形擬桿菌老鼠更容易導(dǎo)致肥胖[29]。

對(duì)這些與臨床相關(guān)的特異性細(xì)菌進(jìn)行研究，有助于將工作化繁為簡(jiǎn)，可以應(yīng)用常規(guī)的一些PCR方法對(duì)這些細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增或定量擴(kuò)增。通過(guò)薈萃分析，我們擬對(duì)T2DM患者腸道特異性細(xì)菌進(jìn)行單獨(dú)或聯(lián)合檢測(cè)，驗(yàn)證其在臨床的應(yīng)用效果。

4　小　結(jié)

盡管這些生物性標(biāo)志物分類的方法需要進(jìn)一步明確，但我們已經(jīng)很清楚在腸道微生物與人類生理狀態(tài)之間存在著臨床相關(guān)的關(guān)聯(lián)性。就像目前研究比較多的腸道菌群與肥胖之間的關(guān)聯(lián)性，微生物的組成以及細(xì)菌性基因豐度等指標(biāo)可以將健康的胖子與患有代謝性疾病的胖子區(qū)分開，以及其干預(yù)后的反應(yīng)。將腸道微生物劃分成特異性生物標(biāo)志物將是一個(gè)很吸引人的方法，通過(guò)集合性的微生物種群組、基因組或菌株等作為一種生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)T2DM。

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2015-12-28修回日期：2016-05-17)

上海市浦東新區(qū)區(qū)科委項(xiàng)目(PKJ2012-Y20)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.035

A

1673-4130(2016)15-2142-04