周義正 綜述，李　艷 審校

(湖北省荊州市中心醫(yī)院　434020)

·綜述·

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子分型及流行病學(xué)研究進(jìn)展

周義正 綜述，李艷 審校

(湖北省荊州市中心醫(yī)院434020)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；分子；分型；流行病學(xué)

隨著抗菌藥物甲氧西林的誕生，1960年在英格蘭的醫(yī)院出現(xiàn)了世界上首例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，隨后的幾十年，世界各地陸續(xù)報道了各種類型的MRSA，包括醫(yī)院相關(guān)性MRSA(HA-MRSA)、社區(qū)相關(guān)性MRSA(CA-MRSA)和家畜相關(guān)性MRSA(LA-MRSA)。1990年以來攜帶殺白細(xì)胞毒素(PVL)的CA-MRSA克隆株在世界范圍內(nèi)廣為傳播，并從社區(qū)傳向醫(yī)療機(jī)構(gòu)，2000年后不斷報道的LA-MRSA感染病例也加劇了MRSA感染的復(fù)雜性[1-4]。為了有效阻止MRSA的蔓延，無論是衛(wèi)生行政部門，還是醫(yī)療機(jī)構(gòu)都在應(yīng)用檢測和監(jiān)控等系列措施加以控制。MRSA的傳播與分子型別相關(guān)，但由于MRSA的分子型別眾多，這對控制MRSA傳播提出了難題，因此了解MRSA的分子型別及流行趨勢對有效控制MRSA的傳播有重要作用。本文將探討MRSA分子分型的主要方法，并關(guān)注HA-MRSA、CA-MRSA和LA-MRSA的最新流行病學(xué)研究進(jìn)展。

1MRSA分子分型方法

目前，MRSA的分子分型方法主要包括脈沖場凝膠電泳(PFGE)、spa分型、多位點(diǎn)序列分型(MLST)、葡萄球菌染色體mec基因盒(SCCmec)分型、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)等。以上MRSA的分子分型方法各有優(yōu)勢和局限性，但應(yīng)用最廣泛的是前4種方法，下面將主要介紹這4種方法的原理、應(yīng)用情況、優(yōu)勢和局限性。

1.1PFGE分型PFGE技術(shù)對MRSA進(jìn)行分子分型的原理如下：首先金黃色葡萄球菌的染色體DNA在限制性酶SmaⅠ的作用下進(jìn)行酶切，接著這些DNA片段在電場可變的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，這些電泳后DNA片段條帶的模式可采用特殊的軟件依照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對分析，從而確定待測MRSA是何種分子型別。PFGE是目前對MRSA進(jìn)行分子分型的最好技術(shù)手段之一，其被認(rèn)為是判斷院內(nèi)MRSA爆發(fā)流行或醫(yī)院間MRSA流行傳播的“金標(biāo)準(zhǔn)”；但其存在耗時、昂貴和重復(fù)性差等局限性，因此其應(yīng)用受到了限制。現(xiàn)在只有少數(shù)國家，例如美國和荷蘭在研究地區(qū)性的標(biāo)準(zhǔn)化PFGE方法對MRSA進(jìn)行分子分型，但這種標(biāo)準(zhǔn)化的PFGE方法尚未在國際上達(dá)成一致。

1.2spa分型金黃色葡萄球菌A蛋白由spa基因編碼，該基因由一系列長度為24 bp的重復(fù)序列組成，重復(fù)序列的多少，以及存在的點(diǎn)突變或缺失構(gòu)成了spa基因的多態(tài)性，F(xiàn)renay等[5]針對spa基因X區(qū)域進(jìn)行序列分析，由此對金黃色葡萄球菌進(jìn)行分子分型，該方法稱為spa分型。spa分型對MRSA基因型別的區(qū)分能力介于PFGE和MLST之間，因此其既可用于MRSA的分子進(jìn)化研究，也可用于監(jiān)測醫(yī)院MRSA的爆發(fā)流行。由于spa分型僅對單個位點(diǎn)進(jìn)行序列分析，因此其區(qū)分能力低于MLST，但比MLST省時、省力，成本也更低廉。在spa分型的發(fā)展中，分別由Koreen等[6]和Harmsen等[7]建立兩種不同的命名體系，這造成不同實(shí)驗(yàn)室間得到的spa分型數(shù)據(jù)存在不可比較性，但StaphType軟件的出現(xiàn)解決了這個問題，其將兩種不同的命名體系統(tǒng)一起來。

1.3MLST分型MLST分型基于金黃色葡萄球菌7個管家基因arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL的序列分析，每個管家基因的序列決定其自己的型別，7個管家基因組成的型別譜決定了金黃色葡萄球菌序列型別(ST)[8]。目前對MRSA進(jìn)行命名時，通常將MLST分析和SCCmec分型結(jié)合起來，例如在德國流行的柏林克隆株被命名為ST45-MRSA-IV?；谙嚓P(guān)序列的分型方法(BURST)可以用來定義同源復(fù)合物(CC)，當(dāng)7個管家基因中有5個相同時可認(rèn)為屬于同一CC。MLST分型的優(yōu)勢在于其標(biāo)準(zhǔn)的命名方法和準(zhǔn)確性，但其也存在耗時、耗力和成本昂貴等局限性。

1.4SCCmec分型SCCmec是存在于所有MRSA中的一種特殊移動基因組件(MGE),其決定MRSA對甲氧西林的耐藥性。SCCmec由3部分組成：(1)mec基因復(fù)合體，主要包括mecA操縱子；(2)ccr基因復(fù)合體，主要包括染色體盒重組酶基因；(3)J區(qū)，即SCCmec兩端和中間連接mec與ccr基因復(fù)合體的區(qū)域，分別被稱為J1、J2和J3。根據(jù)葡萄球菌染色體mec基因盒國際工作組(IWG-SCC)在其官方網(wǎng)站(http://www.sccmec.org/)的最新報道，被發(fā)現(xiàn)的MRSA中mec基因復(fù)合體有5種型別，分別被命名為A、B、C1、C2和E；ccr基因復(fù)合體有8種型別，分別被命名為ccr1、ccr2……ccr8。根據(jù)mec基因復(fù)合體和ccr基因復(fù)合體的不同型別，目前命名SCCmec型別有11種，即SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ……Ⅺ。早期SCCmec分型是基于探針雜交的方法，現(xiàn)在SCCmec分型的主流方法是多重PCR法或?qū)崟r熒光定量PCR法，其中多重PCR法因?yàn)闊o需特殊設(shè)備和相對較低的成本得到更多實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用?？傊?，相對于熒光定量PCR，多重PCR對SCCmec的分型更方便且應(yīng)用更廣，但其需要更多的人力且更耗時。

2目前全球流行MRSA的主要分子型別

2.1HA-MRSA的主要分子型別目前報道最多的HA-MRSA的同源復(fù)合物是CC5、CC8、CC22、CC30和CC45[9-11]，其中CC5和CC8是全球流行范圍最廣的同源復(fù)合物，這兩種同源復(fù)合物有各種ST亞型，其分布在全球各地區(qū)。CC22也呈現(xiàn)全球流行，CC30-ST36在美國和英國很常見，CC45在美國和歐洲更常見[10-11]。在亞洲地區(qū)報道最多的同源復(fù)合物是CC8(ST239)、CC5(ST5)和CC22(ST22)[12-13]。CC8(ST239)、CC5(ST5)和CC30在拉丁美洲流行[14]，CC5、CC8和CC30在非洲流行[15]。

2.2CA-MRSA的主要分子型別目前，全世界報道的CA-MRSA的分子型別超過20種，在流行中占顯著地位的5種分子型別是ST1-Ⅳ、ST8-Ⅳ、ST30-Ⅳ、ST59-Ⅴ和ST80-Ⅳ。由于ST8-Ⅳ和ST30-Ⅳ型別的CA-MRSA被不斷從各大洲檢出，因此這兩種型別被認(rèn)為是最具傳播活力的分子型別。USA300克隆株是ST8-IV型別的代表和典型的CA-MRSA，其具有以下特點(diǎn)：SCCmecⅣ型，PVL基因陽性，并同時對利福平、復(fù)方磺胺甲噁唑、克林霉素和四環(huán)素敏感。ST30-Ⅳ型別常被稱為西南太平洋克隆株，以前認(rèn)為該型別是噬菌體80/81型青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌的子代菌株，但現(xiàn)在的研究表明其與HA-MRSA和EMRSA-16來自相同的祖代菌株CC30。ST30-Ⅳ型CA-MRSA主要流行于澳大利亞、亞洲、南美、歐洲和中東地區(qū)，其常導(dǎo)致嚴(yán)重感染，但與其他分子型別的CA-MRSA相比，其敏感的抗菌藥物更多。

2.3LA-MRSA的主要分子型別目前已經(jīng)報道的LA-MRSA的分子型別有ST1、CC5、ST8、ST9、CC97、ST121、CC126等超過10種，其感染的對象包括人類及各種動物，如牛、豬、馬、鳥等。

3MRSA流行病學(xué)現(xiàn)狀

3.1HA-MRSA流行現(xiàn)狀MRSA在全球的醫(yī)院中廣為流行，HA-MRSA占醫(yī)院感染相關(guān)性金黃色葡萄球菌的比例在世界各地區(qū)不一樣，其中最高的分布在美洲、亞洲和馬耳他地區(qū)，分離率超過50%；其次是中國、澳大利亞、非洲和某些歐洲國家，分離率為25%～50%；有些歐洲地區(qū)如荷蘭和斯堪的納維亞的MRSA分離率很低[16]。最近幾年，HA-MRSA在歐洲有些國家如奧地利、法國、愛爾蘭、英國和希臘的流行呈現(xiàn)下降趨勢；HA-MRSA在東亞地區(qū)的流行呈現(xiàn)兩種趨勢，在印度和菲律賓地區(qū)保持較低水平，但在斯里蘭卡、韓國、越南、泰國、中國臺灣和香港地區(qū)卻保持了很高的水平[17]。最近的一項(xiàng)研究表明，在韓國、中國香港、中國臺灣地區(qū)和越南流行的克隆株CC8-ST239-Ⅲ-t037和在韓國和斯里南卡流行的克隆株CC5-ST5-Ⅱ-t002已經(jīng)從醫(yī)院擴(kuò)散至社區(qū)，從流行病學(xué)角度看，這兩種克隆株已轉(zhuǎn)變?yōu)镃A-MRSA[17]。歐洲的一項(xiàng)關(guān)于侵襲性金黃色葡萄球菌的研究表明，HA-MRSA是侵襲性感染的最主要的金黃色葡萄球菌[16]。有些HA-MRSA的同源復(fù)合物已播散到全球，例如SNP分析表明，CC5同源復(fù)合物通過獲取SCCmec已在多個地區(qū)完成了變異[18]。基因進(jìn)化研究表明，跨洲和在醫(yī)院之間傳播的HA-MRSA的同源復(fù)合物CC8(ST239)已從北美、歐洲、南美和亞洲分離到[19]，該同源復(fù)合物在1990年從南美傳入歐洲，從泰國傳入中國。

3.2CA-MRSA流行現(xiàn)狀1999年，在美國的中西部發(fā)生了4起致命的兒童感染事件，通過調(diào)查，由此揭開了CA-MRSA作為一種新出現(xiàn)MRSA的面紗。2000年初，在美國的運(yùn)動員和囚犯中出現(xiàn)了CA-MRSA感染的暴發(fā)流行，據(jù)當(dāng)時全美11所醫(yī)院的調(diào)查研究表明，97%的CA-MRSA都屬于克隆株USA300(CC8-ST8)。USA300克隆株主要導(dǎo)致皮膚及軟組織感染(SSTI)，也可導(dǎo)致壞死性肺炎等急性感染。和北美相比，CA-MRSA在歐洲的流行程度要低些，其主要流行株ST80-Ⅳ型基本上從每個歐洲國家都能分離出，這也與USA300克隆株在北美的主要流行不同。CA-MRSA在歐洲的首次報道發(fā)生在2003年的希臘，該國也是歐洲CA-MRSA流行最嚴(yán)重的國家[20]。

ST59-Ⅳ型和ST59-Ⅴ型是中國(包括臺灣地區(qū))和其他幾個亞洲國家流行的CA-MRSA兩個主要分子型別[21]，但這兩個型別在歐洲、澳大利亞和美國也有發(fā)現(xiàn)，ST59-Ⅳ型局限于美國，ST59-Ⅴ型分布在亞洲和澳大利亞。ST1-Ⅳ型主要流行于美國的阿拉斯加州及中西部地區(qū)，以及加拿大的中西部地區(qū)；在美國部分ST1-Ⅳ型攜帶PVL基因，但在澳大利亞ST1-Ⅳ型均不攜帶PVL基因[22]。最近幾年，ST772-Ⅴ型(ST1型單位點(diǎn)突變株)在孟加拉國和印度地區(qū)成為一種具有不同尋常毒力和耐藥性的新型CA-MRSA[23]，且在歐洲和英國的報道也不斷增加[24]。

除了以上提到的主要分子型別，CA-MRSA流行株中還有一些比較有意義的型別。例如在韓國流行的ST72-Ⅳ型；偶爾在非洲和亞洲出現(xiàn)的ST88-Ⅳ型；在其他地區(qū)很少出現(xiàn)，但在澳大利亞流行的ST93-Ⅳ型；最近在英國報道的來源于動物但感染人的ST97-Ⅴ型；ST152-Ⅴ和ST377-Ⅴ型與中歐和巴爾干半島流行的CA-MRSA相關(guān)；ST75-Ⅳ型在澳大利亞偏遠(yuǎn)地區(qū)的土著居民中限制性局部流行。

3.3LA-MRSA流行現(xiàn)狀2003年，原本在豬和牛中流行的，屬于CC398同源復(fù)合物的LA-MRSA被首次從人體內(nèi)檢出[2]，盡管在美國和亞洲有零星報道，但CC398同源復(fù)合物的LA-MRSA主要在來自歐洲。2007年歐洲17個國家的24個實(shí)驗(yàn)室共同完成的一項(xiàng)研究顯示，屬于CC398同源復(fù)合物的LA-MRSA占感染人所有MRSA的比例非常小，且與當(dāng)?shù)厣蟮拿芏扔嘘P(guān)，大部分分離的CC398同源復(fù)合物的LA-MRSA來自荷蘭、比利時、丹麥和奧地利[2]。在德國與荷蘭接壤的地區(qū)，CC398同源復(fù)合物的LA-MRSA分離率較高，可占當(dāng)?shù)厮蟹蛛xMRSA的11%～20%，這與當(dāng)?shù)剌^高密度的生豬養(yǎng)殖業(yè)有關(guān)[25-26]。歐洲相關(guān)研究的證據(jù)表明LA-MRSA未大規(guī)模播散到醫(yī)院，各地出現(xiàn)的LA-MRSA感染人的病例也是由該地區(qū)高密度的生豬養(yǎng)殖造成的，侵襲性的LA-MRSA在歐洲較少見[16]。荷蘭51家醫(yī)院的研究表明，屬于CC398同源復(fù)合物的LA-MRSA比院內(nèi)感染的其他MRSA要少72%左右[27]。針對德國32個家庭病房的研究表明，雖然MRSA已從醫(yī)院播散到家庭病房，但還沒有證據(jù)表明家庭病房中出現(xiàn)了LA-MRSA和CA-MRSA[28]。在歐洲，經(jīng)常接觸牲畜的人攜帶LA-MRSA很普遍，但引起的感染卻不多。荷蘭的研究表明，LA-MRSA感染的危險人群包括在養(yǎng)殖場直接接觸牲畜的工人和在屠宰場接觸生豬的工人[26]。雖然屬于CC398同源復(fù)合物的LA-MRSA通常能在人體正常定植，但過去幾年也有其導(dǎo)致皮膚及軟組織感染、心內(nèi)膜炎、肺炎和壞死性筋膜炎的報道。

4小結(jié)

在過去的幾十年，MRSA已流行在全球大部分地區(qū)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，其分離率也快速增加。CA-MRSA的某些型別已在社區(qū)廣泛傳播并播散到了世界許多地區(qū)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)。CA-MRSA的出現(xiàn)及其快速傳播對那些低水平流行MRSA的國家來說是一種挑戰(zhàn)，MRSA的這種流行病學(xué)的改變對公共衛(wèi)生是嚴(yán)重威脅。所以持續(xù)不斷采取各種先進(jìn)方法對感染人或動物的MRSA進(jìn)行分子流行病學(xué)研究是十分必要的，這不僅能為MRSA的感染提供制定合適治療方案和有效感染防控措施的依據(jù)，更能對這種嚴(yán)重威脅人類健康的細(xì)菌進(jìn)行有效監(jiān)控。

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2016-03-01修回日期：2016-03-28)

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1673-4130(2016)12-1669-04