張立新

酶抑制法快速定性檢測水果中農(nóng)藥殘毒

張立新

（河北省唐山市林果花質量監(jiān)督檢驗管理中心063000）

人們對餐桌上種類繁多的新鮮水果食用安全的要求隨著生活水平的逐步提高也越來越高。加強果品質量監(jiān)控，尤其是加強水果農(nóng)藥殘毒檢測，是提高果品質量安全水平，保障百姓“舌尖上的安全”的關鍵措施之一。采用氣象色譜儀檢測水果農(nóng)藥殘毒，固然以其精度高、檢測項目較多等特點而為大多實驗室所采用。但是，此檢測方法儀器設備投入資金數(shù)額大、檢測成本高、檢測場所固定、檢測環(huán)境條件要求高、人員操作技術水平要求較高等特點決定了不太適合生產(chǎn)基地和流通領域要求的快速檢測。采用酶抑制方法，對水果中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行定性快速檢測，儀器和試劑投入成本低、檢測方法簡便易學、檢測速度快、檢測不受實驗場所的限制，是水果生產(chǎn)基地和超市、水果店等流通領域快速自行檢測的實用方法。

1 酶抑制法工作原理

有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制昆蟲中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酶的活性，造成神經(jīng)傳導介質乙酰膽堿的積累，影響正常傳導，使昆蟲中毒死亡。根據(jù)這一原理，在水果有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥提取液中加入類似于乙酰膽堿酶的酶試劑，如果水果提取液中不含有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或殘留量較低，酶的活性不被抑制或抑制程度小，實驗中加入的底物就被酶水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應產(chǎn)生顏色變化。反之，如果水果提取液中含有一定量的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，酶的活性就被抑制或部分被抑制，實驗中加入的底物就不能被酶水解或少部分被水解，從而不顯色或顏色變化很小。用分光光度計測定吸光值隨時間的變化情況計算出抑制率，就可以判斷水果中含有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留情況。

2 儀器、試劑與判定標準

北京強盛儀器廠生產(chǎn)的NY-III型6通道農(nóng)藥殘毒檢測儀、NY-Ⅳ型8通道農(nóng)藥殘毒檢測儀；配套上海瑞鑫科技儀器有限公司出品的農(nóng)藥殘毒速測試劑，包括提取液試劑1袋、底物1瓶、顯色劑1瓶和酶試劑1瓶，應由專業(yè)商家購買；測試結果為有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥對酶的抑制率（%）；測試結果判讀標準為測試樣品的酶抑制率達到50%以上，其農(nóng)藥殘留毒性可能超過安全界定標準。適應檢測的水果有蘋果、梨、桃、李、杏、香蕉、火龍果、芒果、獼猴桃、木瓜、柚和檸檬等。

3 檢測方法

3.1 試劑配制與保存

3.1.1 提取液配制將提取液試劑袋中的試劑溶于510 mL蒸餾水中，溶解、混勻，配成提取液。

3.1.2 底物配制向底物試劑瓶中加入3.1 mL蒸餾水，溶解、混勻，備用。在0～4℃環(huán)境保存，可使用5 d。

3.1.3 顯色配制向顯色劑試劑瓶中加入32 mL提取液，溶解、混勻，備用。避光冷藏保存。

3.1.4 酶試劑配制向酶試劑瓶中加入3.1 mL提取液，溶解、混勻。在0～4℃環(huán)境保存，可使用5 d。

3.1.5 未經(jīng)配制的酶、底物粉劑儲存在冰箱0℃以

下冷凍室保存，有效期為1年。

3.2 操作步驟

3.2.1 準備開機預熱10 min，按確定鍵進行儀器自檢。隨機抽取水果樣本，每個樣本至少取0.5～1.0 kg，樣品必須具有代表性。

3.2.2 樣品提取從水果表皮至果肉0.5～1 cm處取樣，取1 g放入燒杯中，加入5 mL提取液，常溫下靜置10 min，每隔3 min晃動一下燒杯，以使水果中農(nóng)藥充分溶解，或振蕩提取2 min，過濾，濾液即為待檢測液。NY-III型儀器提取6個樣品，NY-Ⅳ型提取8個樣品.

3.2.3 對照測試對照測試在樣本測試之前4 min進行。取提取液2.5 mL、酶0.1 mL和0.1 mL顯色劑，加入燒杯中，混勻靜置15 min（常溫25～35℃，秒表計時）后，立即加入底物0.1 mL。倒置兩次混勻后（切勿震蕩產(chǎn)生氣泡），立即轉移到比色皿中，快速放入儀器比色池內，蓋好蓋板，按對照測試鍵。對照值在30以上為有效值，反之重做對照測試。測試完畢，馬上將對照液從比色池內取出。

3.2.4 樣品測試取待撿測液2.5 mL加入燒杯中，加入酶液0.1 mL和顯色劑液0.1 mL，混勻靜置15 min（秒表計時，常溫25～35℃）后，馬上加入底物0.1 mL，倒置兩次后（切勿震蕩產(chǎn)生氣泡），立即轉移到比色皿中，快速放入儀器比色池，蓋好蓋板，按樣品測試鍵執(zhí)行樣品檢測程序。

3.2.5 測試結果的判讀若測試樣品的酶抑制率達到50%以上，則表明被測樣品的農(nóng)藥殘留毒性可能超過安全的界定標準，建議復檢一次或通過氣相色譜等儀器檢測進一步確認。

4 檢測結果誤差分析

4.1 實驗操作誤差

4.1.1 移液操作帶來的誤差實驗過程中，試劑都是通過移液槍進行添加的。如果按下移液槍后，松手過快會導致所吸液體中含有很多空氣，造成所加試劑量減少，影響檢測結果。操作過程中，在所剩試劑比較少的情況下，應慢松移液槍按鈕，確保吸入試劑足量。

4.1.2 操作速度快慢帶來的誤差提取液與樣品混合時間越長，越有利于農(nóng)殘溶解，檢測結果為不合格的概率就越大。加入酶后放置的時間越長，越有利于使酶被充分破壞，檢測結果為不合格的概率就越大。應提高操作熟練程度，按照要求時間進行操作。

4.1.3 顯示時間帶來的誤差同時檢測多個樣品時，倒計時顯示的時間每次都有差別，誤認為是儀器出現(xiàn)了問題。每次放入比色皿并按下檢測鍵的時候，內部計時器都開始180 s倒計時。8個通道的180 s倒計時不是同時開始的，它們之間的時間差即為操作時間。所以最后顯示的時間因操作的快慢有所不同，屬于正?，F(xiàn)象，可以放心操作。

4.1.4 揭遮光蓋時帶來的誤差每次放入待檢測的比色皿都需要掀起儀器的遮光蓋，自然光都會投射進正在檢測的比色皿，影響折光率的判斷，進而影響檢測結果。操作過程中，要盡可能快速完成比色皿的放置，減少遮光蓋打開的時間。

4.2 實驗環(huán)境和器皿導致誤差

4.2.1 環(huán)境溫度變化帶來的誤差實驗室溫度的變化，可以造成測試溫度與對照溫度的不一致，從而降低吸光值變化曲線的吻合度，導致抑制率的升高，增加檢測結果不合格的概率。同時，溫度對溶解速度、酶的活性都有影響。應在實驗室安裝空調，按照儀器要求調整好溫度。

4.2.2 比色皿帶來的誤差比色皿分為透光面和磨光面。在檢測過程中，透光面表面有水痕、手痕、污跡都會影響儀器對折光率的判斷，造成檢測結果不準確。檢測前應將比色皿清洗干凈，操作過程中保持透光面無污物接觸。

4.3 檢測樣本自身導致誤差

4.3.1 取樣本果皮厚度帶來的誤差所取果皮的厚度，對檢測結果有非常重要的影響。果皮越薄，接觸農(nóng)藥的面積越大，檢測結果為不合格的概率就越大。果皮越厚，所含的果汁和色素就越多，對檢測結果造成的誤差就越大。應該按照要求從水果表皮至果肉0.5～1 cm處取樣。

4.3.2 水果色素帶來的誤差儀器通過測定吸光值隨時間變化情況來進行檢測。部分水果中含有的色素會影響儀器對吸光值的判斷。對于色素顏色較深的水果品種，應采用較為精密的儀器進行檢測。

4.3.3 水果果汁帶來的誤差果汁中含有酸（堿）性物質對于酶的活性、提取液的溶解度、顯色劑的靈敏度等都會造成影響，從而降低檢測結果準確性。取樣過程中應盡量采用較鋒利的刀具，減少擠出的果汁量。

4.4 介質、試劑導致誤差

4.4.1 水質帶來的誤差不同水的成分差別較大。水中含有的礦物質成分、酸性物質、堿性物質，都會對檢測結果產(chǎn)生影響。實驗過程中應采用蒸餾水，如條件有限，可用瓶裝純凈水代替。

4.4.2 各種試劑帶來的誤差提取液量多可以稀釋農(nóng)殘，酶量多可以提高分解底物的速度，顯色劑量多可以增加顯色的程度，底物量多可以提高酶的利用效率，以上這些因素都能增加檢測結果合格的可能性。檢測過程中的試劑使用量是經(jīng)過科學計算的，應嚴格遵守。

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