王　濤，于永慧 綜述，宋立華 審校

(軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所/病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071)

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·綜述·

貝氏柯克斯體的相變異與脂多糖研究進展

王濤，于永慧 綜述，宋立華△審校

(軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所/病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071)

貝氏柯克斯體；立克次體；Q熱；脂多糖

貝氏柯克斯體(Cb)為一類兼性細胞內寄生的革蘭陰性小桿菌，歸屬于軍團菌目，柯克斯體科，柯克斯體屬。傳統(tǒng)上，因為Cb有類似立克次體的生物學特征，Cb被歸類到立克次體目中，俗稱為Q熱立克次體，但其與立克次體目內各種菌株的親緣關系相距較遠。Cb地理分布廣泛，在羊、牛等家畜中感染率高[1-2]。Cb通過氣溶膠感染人可導致急性或慢性Q熱病，在部分患者中引起肺炎、肝炎、心內膜炎和脊髓炎等重癥疾病。由于易于獲得及具有很強的感染性，Cb被列為生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑。脂多糖(LPS)是Cb的重要毒力因子和關鍵保護性抗原，含有兩種特有糖組分維瑞糖(Vir)和雙氫羥基鏈霉糖(Strep)。不同Cb分離株在雞胚或細胞上傳代后都能發(fā)生不可逆的Ⅰ～Ⅱ相的相變異。目前已知的Cb相變異均與LPS發(fā)生結構變異有關。LPS發(fā)生變異的原因主要是缺失O抗原、或缺失某種特有糖組分。本文在Narasaki等[3]的研究基礎上，進一步分析了Cb相變異、LPS的結構與生物合成，為下一步LPS應用基礎研究提供借鑒。

1　Cb的相變異

Cb相變異與經典的細菌相變異有兩點差異，一是Cb的相變異發(fā)生在數十次甚至百次以上用雞胚或細胞(不是動物或蜱等天然宿主)傳代培養(yǎng)Cb的過程中，二是Cb的相變異是不可逆的減毒過程。Cb相變異的實質是在雞胚或細胞上傳代時Ⅰ相Cb發(fā)生了適應性遺傳變異成為Ⅱ相(有時為中間相Crazy變異株)，這些變異在這兩種系統(tǒng)中無一例外均與LPS結構變化有關。在不同的九里克隆株中，Ⅰ相LPS(LPSⅠ)的O-PS最長，Ⅱ相LPS(LPSⅡ)不含O-PS，而Crazy變異株(LPS Cr)的O-PS長度介于Ⅰ～Ⅱ相范圍內。Cb相變異為研究LPS的功能提供了天然的突變體。

Cb相變異的遺傳機制仍懸而未決。九里Ⅱ相株RSA 439中有大片段染色體(25、992 bp)刪除突變和13個點突變[4]，九里Crazy變異株RSA514在Ⅱ相株刪除突變基礎上有更多的基因缺失(31、568 bp)，這里奇怪的是LPS Cr的復雜性介于LPSⅠ與LPSⅡ之間[5]。另外，國外已對多株Ⅰ相和Ⅱ相菌進行了全基因組測序[6]，但目前還沒有看到相變異相關的生物信息學分析，這可能是由于不同菌株間的全基因組序列差異較大，很難將相變原因歸結到少數基因差異上。

Cb在無細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中是否有類似的相變異是個新課題，還沒有明確的研究。Kuley等[7]對多株Ⅰ相菌在無細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中進行30次以上傳代，發(fā)現多個LPS相關基因的表達水平下降，且這些基因的重測序覆蓋度有類似的下降，說明可能存在上述類似的基因刪除導致的相變異。雖然Cb相變異的遺傳機制還不明確，但已明確的是在細胞或雞胚生長模型上相變異會大幅度提高Cb的感染性。在無細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，Ⅱ相菌是否有顯著的生長優(yōu)勢還不清楚。另外，現有的無細胞培養(yǎng)系統(tǒng)需要嚴格的低氧條件，還有待改進。可以預測的是，Cb在不同無細胞培養(yǎng)條件下的適應性生長變異將是本領域的研究熱點。

2　Cb的LPS分型

LPS是很多革蘭陰性菌的血清型特異性抗原，但目前還沒有Cb血清學分型研究。由于LPS是Cb的關鍵保護性抗原，深入理解不同Cb分離株間的LPS結構和抗原性差異對研制多價糖結合疫苗有重要意義。有研究發(fā)現Cb分離株中至少存在3種LPS化學型，3者之間的帶型差異可能與導致急性或慢性Q熱相關[8]，與Cb LPS化學型相關的遺傳機制還不清楚。廣泛的地理分布和宿主多樣性提示Cb存在更多的表型和遺傳多樣性。Vir和Strep是Cb LPS的特有糖組分，但是否是Cb毒株的共有組分值得進一步研究。今后有必要分離鑒定更多來自不同地區(qū)的Cb分離株，深入分析不同分離株的LPS組分和結構差異。

3　Cb的LPS化學組成與結構

前期對Cb LPS的研究主要來自九里、Henzerling、Priscilla和S株。九里LPSⅠ至少有3個主要的組分，相對分子質量分別是19.0、15.0、14.3×103，九里或澳大利亞QD株LPSⅡ的相對分子質量是2.5×103，九里LPS Cr的相對分子質量是14.3×103[9]。雖然在九里株中Ⅰ相、中間相和Ⅱ相的LPS分子量在總體上呈梯度下降，但澳大利亞AUSTⅡ株LPSⅡ與九里LPS Cr的大小相同[5]，說明LPS分子量與Ⅱ相血清反應特性間無必然聯(lián)系。

3.1Ko-Kdo-lipidA基因革蘭陰性菌內毒素的主要活性成分是Kdo2-lipidA基團。最新研究提示，Cb的Kdo2-lipidA基團實質上是Ko-Kdo-lipidA，該結構還存在于鼠疫菌、鼻疽菌、肺炎克雷伯菌、長灘軍團菌和植物病原體青枯菌等[10]。目前還不清楚Ko-Kdo-lipidA是否為Cb生長所必需的組分，但該基團可能與Cb全菌滅活苗的不良反應相關。Ko位于Kdo的外側，比Kdo多了1個氧原子。有研究表明鼠疫菌的Kdo加氧酶(KdoO)活性需要空氣氧濃度[10]。KdoO是Cb中唯一已知的Kdo2-lipidA修飾酶。目前較少有Cb Ko或KdoO相關研究。Ko提高了Ko-Kdo-lipidA的抗酸水解能力。對于Cb，Ko可能對其在酸性囊泡內增殖有重要意義。

lipidA由脂肪酸鏈通過酯鍵或酰胺鍵與葡萄糖胺(GlcN)二糖組成。Toman等[11]發(fā)現Henzerling和S株兩株菌的lipidA GlcN二糖連接有4個?；簝蓚€酰胺3-羥基脂肪酸和兩個酯鍵非羥基脂肪酸。研究進一步發(fā)現Priscilla株LPSⅠ的兩個主要組分均含四?；鵯ipidA，有經典的雙磷酸GlcN二糖骨架，二糖均通過酰胺鍵連接3-羥基十六烷酸或異分支3-羥基十六烷酸，其中一種LPS組分的2個GlcN均通過酯鍵連接十六烷酸，而另一種LPS組分的第二個GlcN通過酯鍵連接反異式分支十五烷酸[12]。鼠疫菌在37 ℃培養(yǎng)時表達的lipidA具有類似的四?；Y構，重要的是鼠疫菌和Cb的lipidA均為TLR4的拮抗劑，而不是激活劑[13]。

3.2核心糖一般認為Cb LPS內核寡糖的成分有Kdo、甘露糖和甘油甘露庚糖，而外核寡糖的成分主要是甘露糖和甘油甘露庚糖[3]。Cb LPS的內核和外核寡糖的具體結構還不清楚。抗體是研究LPS結構的重要工具?，F有研究表明，LPSⅠ與LPSⅡ可能有不同的內核寡糖結構，這是因為LPSⅡ有內核寡糖，無外核寡糖，但LPSⅡ抗體不能與LPSⅠ發(fā)生反應[14]。與該研究不一致的是，Wen等[15]研究發(fā)現LPSⅠ特異的單抗也可以識別GritaⅡ相株的LPS，但Grita LPSⅢ是否缺失外核寡糖和O抗原還不清楚。還有團隊研制了中和抗體1E4，可特異性識別14×103條帶，其中和表位可能位于外核寡糖[16-17]，這可解釋Ⅱ相菌為什么不能用于研制Q熱全菌滅活苗。事實上，LPS Cr的相對分子質量為14×103，而且九里LPSⅠ也有14×103條帶[9]，加上不同LPSⅠ組分很可能有相同的核心糖結構，這說明1E4有可能識別的是O-PSⅠ特定組分，該組分是否是LPS Cr值得研究。

3.3O抗原現已知道Cb O-PSⅠ在Cb致病力上發(fā)揮關鍵作用，O-PSⅠ在單個菌體表面存在多種不同大小的組分，如九里株至少有3個主要組分[9]，目前還沒有對單種組分的組成、結構與功能的研究。另外，不同Cb分離株間的O-PSⅠ種類也存在差異。但總體上，O-PSⅠ至少含有以下幾種糖：Vir、Strep、甘露糖等。如前所述，Vir和Strep是Cb O-PS的標志物。除了前述的Cb O-PS的長度差異，一般認為同時含有Vir和Strep的為LPSⅠ，缺失Vir的為LPS Cr，二者均缺失的為LPSⅡ。Vir和Strep兩種獨有成分可能位于O-PSⅠ的末端，與Cb的免疫調節(jié)活性有關[3]。AUSTⅡ株LPSⅡ和LPS Cr均含有Strep(無Vir)，它們的長度介于九里LPSⅠ和九里LPSⅡ之間，說明Vir可能與合成長鏈O-PS有關，或者Vir起到接頭的作用以延長O-PSⅠ并調節(jié)其構象[5]。需要說明的是，九里Crazy變異株RSA514分離自被九里Ⅰ相株感染343 d的豚鼠胎盤，與Ⅰ相抗血清有弱反應，與Ⅱ相抗血清無反應，其LPS Cr只有1條14×103條帶。

4　Cb LPS的生物合成

盡管LPS是公認的Cb關鍵毒力因子，但由于研究困難，Cb LPS的合成途徑嚴重缺乏研究。目前對Cb LPS合成途徑的理解多是基于蛋白質同源性分析和功能預測，缺乏實驗數據，Narasaki等[3]詳盡綜述了這方面的進展。筆者在這里進行簡要摘譯補充，因為LPS合成途徑與研制Q熱疫苗聯(lián)系密切，例如在大腸埃希菌(E.coli)中重組表達Cb特有的單糖或寡糖結構以研制Q熱糖結合疫苗等。

4.1lipidA與核心寡糖的合成E.coli的Kdo2-lipidA合成途徑，又稱Raetz途徑，共有9種酶依次參與，這些酶的同源基因存在于包括Cb在內的幾乎所有革蘭陰性菌[18]。雖然這些酶的種類保守，但不同菌的脂質A組分及結構都有差異。在Raetz途徑的9種酶中，LpxC是很好的藥物靶標，因為該酶與其他脫乙酰酶或酰胺酶無同源性且被認為是菌體生長必需的酶。脂質A或其組分與Cb繁殖間的關系還有待研究。Ko-Kdo-lipidA合成酶類在Cb基因組中散在分布，但核心寡糖與O抗原合成酶類聚集在Cb基因組的3個區(qū)域(見4.2)，這些酶類仍有待鑒定。

4.2特異多糖的合成[3]Cb基因組的3個區(qū)域可能與O-PSⅠ合成有關：第Ⅰ區(qū)是605781～653889，包含了九里Cr RSA514的刪除突變區(qū)域，可能與Vir合成相關；第Ⅱ區(qū)是775635～813578，可能與O-PSⅠ骨架糖類的合成相關；第Ⅲ區(qū)是1760021～1768371，可能與Strep的合成相關。其中CBU0691和CBU0683可能分別是Vir和Strep的合成酶[19]。另外，Cb基因組編碼兩個ABC轉運系統(tǒng)的通透酶基因CBU0703和CBU0704。ABC系統(tǒng)通常轉運線性O-PS，而Wzy途徑運送具有分支結構的O-PS。目前的生物信息學分析還沒有在Cb中發(fā)現Wzy途徑相關基因，因此Cb O-PS Ⅰ可能為線性結構，但還有待證實。

5　小結與展望

作為Cb外膜的主要結構組分，LPS是Cb的關鍵毒力因子和保護性抗原，在調節(jié)及逃逸宿主免疫方面發(fā)揮重要功能。關于Cb LPS的致病機制研究進展，筆者已另文總結[20]。Cb LPS及其兩種特有組分Vir和Strep在研制Cb疫苗和免疫調節(jié)劑等方面的應用仍有待開發(fā)。因為研究人員早已發(fā)現Cb全菌苗或氯仿甲醇沉淀組分可誘導很強的特異性和非特異性免疫保護作用[21]，并已明確LPS是關鍵的保護組分。傳統(tǒng)上Cb培養(yǎng)和操作困難，但Cb無細胞培養(yǎng)和遺傳操作技術的出現為深入研究Cb LPS的合成及表達調控等方面提供了機遇[22-24]。

基于Cb O-PS的糖結合疫苗是有潛力的Q熱候選疫苗，一個重要問題是在無細胞培養(yǎng)條件下Cb是否能穩(wěn)定表達含有兩種特有組分的O抗原。Kuley等[7]在多株Ⅰ相菌中發(fā)現Ⅰ相菌經無細胞傳代30次以上后LPS相關基因的表達水平顯著下降，進一步說明深入理解相變異或者LPS在不同培養(yǎng)條件下的適應性結構變異對研制Cb糖結合疫苗有重要意義。需要指出的是，雖然Cb可以在體外無細胞培養(yǎng)，有研究者仍認為Cb歸屬于專性胞內寄生菌，因為當前的無細胞培養(yǎng)需要嚴格低氧條件。今后隨著培養(yǎng)方法的不斷改進，Cb LPS的適應性表達需要進一步研究。

綜上所述，現有研究對Cb LPS的生物合成、組分改變、結構修飾等有限。以下幾個問題將是今后Cb LPS的重要研究方向：(1)不同Cb分離株的LPSⅠ有何異同；(2)不同分子量的LPSⅠ是否有不同的組成與結構差異；(3)不同分子量的LPS是否有不同的免疫調節(jié)功能及致病力；(4)能否在E.coli中重組不同分子量LPSⅠ的合成途徑；(5)能否利用無細胞培養(yǎng)技術分離鑒定更多的CbⅡ相變異株以研究相變異的遺傳學機制；(6)能否改進無細胞培養(yǎng)技術以研制Q熱糖結合疫苗。

[1]El-Mahallawy HS,Kelly P,Zhang J,et al.High seroprevalence of Coxiella burnetii in dairy cattle in China[J].Trop Anim Health Prod,2016,48(2):423-426.

[2]El-Mahallawy HS,Lu G,Kelly P,et al.Q fever in China:a systematic review,1989-2013[J].Epidemiol Infect,2015,143(4):673-681.

[3]Narasaki CT,Toman R.Lipopolysaccharide of coxiella burnetii[J].Adv Exp Med Biol,2012,984(1):65-90.

[4]Howe D,Shannon JG,Winfree S,et al.Coxiella burnetii Phase Ⅰ and Ⅱ variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages[J].Infect Immun,2010,78(8):3465-3474.

[5]Hoover TA,Culp DW,Vodkin MH,et al.Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants,phase Ⅱ and RSA 514(crazy),of the Coxiella burnetii nine mile strain[J].Infect Immun,2002,70(12):6726-6733.

[6]Karlsson E,Macellaro A,Bystr?m M,et al.Eight new genomes and synthetic controls increase the accessibility of rapid melt-MAMA SNP typing of Coxiella burnetii[J].PLoS One,2014,9(1):e85417.

[7] Kuley R，Smith HE，Frangoulidis D，et al.Cell-free propagation of Coxiella burnetii does not affect its relative virulence[J].PLoS One，2015，10(3):121-126.

[8]Hackstadt T.Antigenic variation in the phase I lipopolysaccharide of Coxiella burnetii isolates[J].Infect Immun,1986,52(1):337-340.

[9]Beare PA,Samuel JE,Howe D,et al.Genetic diversity of the Q fever agent,Coxiella burnetii,assessed by micro array-based whole-genome comparisons[J].J Bacteriol,2006,188(7):2309-2324.

[10]Chung HS,Raetz CR.Dioxygenases in burkholderia ambifaria and yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(2):510-515.

[11]Toman R,Hussein A,Palkovic P,et al.Structural properties of lipopolysaccharides from Coxiella burnetii strains Henzerling and S[J].Ann N Y Acad Sci,2003,990(16):563-567.

[12]Toman R,Garidel P,Andr? J,et al.Physicochemical characterization of the endotoxins from Coxiella burnetii strain Priscilla in relation to their bioactivities[J].BMC Biochem,2004,5(1):121-130.

[13]Zamboni DS,Campos MA,Torrecilhas AC,et al.Stimulation of toll-like receptor 2 by coxiella burnetii is required for macrophage production of pro-inflammatory cytokines and resistance to infection[J].J Biol Chem,2004,279(52):54405-54415.

[14]Hackstadt T.Steric hindrance of antibody binding to surface proteins of Coxiella burnetti by phase I lipopolysaccharide[J].Infect Immun,1988,56(4):802-807.

[15]Wen BH,Yu SR,Yu GQ,et al.Analysis of proteins and lipopolysaccharides from Chinese isolates of Coxiella burnetii with monoclonal antibodies[J].Acta Virol,1991,35(6):538-544.

[16]Peng Y,Zhang Y,Mitchell WJ,et al.Development of a Lipopolysaccharide-Targeted peptide mimic vaccine against Q fever[J].J Immunol,2012,189(10):4909-4920.

[17]Peng Y,Schoenlaub L,Elliott A,et al.Characterization of a lipopolysaccharide-targeted monoclonal antibody and its variable fragments as candidates for prophylaxis against the obligate intracellular bacterial pathogen Coxiella burnetii[J].Infect Immun,2014,82(11):4530-4541.

[18]王小元．革蘭氏陰性細菌脂多糖分子Kdo_2-lipid A基團的結構修飾[J]．微生物學報，2013，53(2)：111-117．

[19]Seshadri R,Paulsen IT,Eisen JA,et al.Complete genome sequence of the Q-fever pathogen Coxiella burnetii[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(9):5455-5460.

[20]王濤，宋立華．貝氏柯克斯體的分子致病機理研究進展[J]．中國人獸共患病學報，2015，31(9)：876-880．

[21]孫長儉,陳梅玲,楊曉,等.氯仿-甲醇提取貝氏柯克斯體殘存組分Q熱疫苗的免疫原性及免疫保護性研究[J].中國人獸共患病學報,2007,23(6):544-547.

[22]Beare PA,Heinzen RA.Gene inactivation in Coxiella burnetii[J].Methods Mol Biol,2014,1197(1):329-345.

[23]Beare PA.Genetic manipulation of Coxiella burnetii[J].Adv Exp Med Biol,2012,984(1):249-271.

[24]Omsland A.Axenic growth of Coxiella burnetii[J].Adv Exp Med Biol,2012,984(1):215-229.

病原微生物生物安全國家重點實驗室自主課題(SKLPBS1409)。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.029

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1673-4130(2016)17-2431-03

2016-02-18

2016-04-25)