康艷麗 綜述,曹穎平 審校

(福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科,福州 350000)

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·綜述·

肺癌的液體活檢和檢測技術(shù)進展

康艷麗 綜述,曹穎平△審校

(福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科,福州 350000)

液體活檢；循環(huán)腫瘤細胞；循環(huán)腫瘤DNA；微小核糖核酸；外泌體

原發(fā)性肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，2013年我國主要癌癥發(fā)病順位和死因順位排第一的均是肺癌，肺癌年齡標化病死率高達40.41/10萬。肺癌具有發(fā)病率高、發(fā)病機制復雜、早期難以發(fā)現(xiàn)、治療效果不佳等特點。腫瘤標志物有助于早期診斷肺癌，對早發(fā)現(xiàn)、早治療有重要作用，并在精準醫(yī)療和個體化治療中起重要作用。根據(jù)《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015版)》，癌胚抗原、細胞角蛋白19片段抗原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和胃泌素釋放前肽及鱗狀上皮細胞癌抗原已被推薦為常用的原發(fā)性肺癌標志物[1]。數(shù)據(jù)庫顯示，在初診時57%的肺癌患者已經(jīng)發(fā)生了遠處轉(zhuǎn)移[2],所以發(fā)現(xiàn)新的用于早期診斷和個體化治療的腫瘤標志物十分必要。

小活檢組織標本肺癌病理診斷主要為明確有無腫瘤及腫瘤類型[3]。由于活檢具有創(chuàng)傷性，且多次活檢患者的依從性差，液體活檢成為當下熱門研究方向。液體活檢的優(yōu)點包括以下幾項：無創(chuàng)傷，標本容易獲取，可以反映腫瘤的整體狀態(tài)，可以實現(xiàn)實時監(jiān)測。液體活檢項目目前主要包括循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、微小核糖核酸(miRNA)和外泌體等。

1　CTCs

1.1CTCs作為潛在標志物的研究進展CTCs是由原發(fā)腫瘤細胞脫落到循環(huán)血液中形成，它具有原發(fā)性腫瘤的特征，是潛在的生物標志物[4]。CTCs可以作為療效評測指標。在一項研究中，非小細胞肺癌(NSCLC)放療前檢測了CTCs數(shù)量，隨著放療后腫瘤縮小，CTCs數(shù)量也減少，表明CTCs可以作為放療療效評測指標[5]。CTCs也可作為預(yù)后指標。有研究報道，Ⅴ期的CTCs數(shù)量高于Ⅲ期患者，且治療前較少CTCs的患者治療后的總生存期和無進展生存期更長，表明CTCs是潛在的預(yù)后指標[6]。CTCs作為活的腫瘤細胞實體，可提供突變和藥物敏感性分析變化。其細胞的完整性可進行細胞水平的研究，從DNA、RNA、表觀遺傳學等方面提供信息。

1.2CTCs的檢測技術(shù)進展CTCs在血液中含量少，大概每100萬血細胞(1 mL血液)中混雜1個腫瘤細胞。因此進行CTCs研究時必須先進行富集，可采用免疫親和、免疫磁珠標志、RT-PCR、CTC chip等方法。CTCs的檢測方法包括計數(shù)、免疫熒光、原位雜交、細胞培養(yǎng)、測序等方法。其中CTCs全基因組擴增和檢測方法包括基于PCR的qPCR、ARMs-PCR、ME-PCR、dPCR和基于二代測序的Thermo Fisher等方法。

1.3CTCs的臨床局限性CTCs同時具有局限性，其分離需要特殊設(shè)備，難以確定是否為真正的腫瘤細胞，因此依賴單細胞測序技術(shù)的發(fā)展。CTCs具有腫瘤異質(zhì)性，樣本代表性不強。這些問題仍然影響其在臨床運用。

2　ctDNA

2.1ctDNA作為潛在標志物的研究進展人體的血液中存在血漿游離DNA(cfDNA),其中攜帶腫瘤特有突變信息的成為ctDNA。ctDNA來源于壞死的或者凋亡的腫瘤細胞[7]。研究表明，ctDNA可以用來重建腫瘤基因[8]。Qiu等[9]指出，ctDNA是表皮生長因子受體(EGFR)基因突變狀態(tài)檢測中具有高特異性和有效性的生物標志物，ctDNA的分析將是非小細胞肺癌的個性化癌癥治療的一個關(guān)鍵部分。Nie 等[10]指出，許多基因的改變，如基因突變、雜合性缺失、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和基因甲基化，均可在非小細胞肺癌患者ctDNA中發(fā)現(xiàn)。因此這些結(jié)果表明ctDNA可以作為一個可行的工具來監(jiān)測NSCLC。研究表明，ctDNA檢測腫瘤變異比CTCs有更高的敏感性[11]。目前ctDNA被CFDA推薦用于晚期NSCLC中血漿EGFR的檢測。最近研究表明ctDNA涵蓋腫瘤整體突變信息，比局部組織活檢更具有惡性整體表現(xiàn)[12]。其攜帶某種腫瘤特異性突變或其他基因組改變信息，可用于早期篩查，表現(xiàn)為假陽性低，特異性好，可攜帶腫瘤細胞的體細胞突變。

2.2ctDNA的檢測技術(shù)進展ctDNA在腫瘤患者體內(nèi)的含量很低，約占整體cfDNA的1%，半衰期短，約為2 h。因此需要靈敏度高的檢測技術(shù)。目前常用的有digital PCR、BEAMing、標記擴增深度測序和癌癥個體化深度測序等方法[13]。

2.3ctDNA的臨床局限性ctDNA數(shù)量少，且容易被正常的cfDNA掩蓋，因此需要進一步提高靈敏性。ctDNA檢測結(jié)果無法定位，無法檢測蛋白質(zhì)，無法從細胞層面進行功能研究。而且，目前由于技術(shù)的局限，ctDNA尚無統(tǒng)一的標準，給臨床使用帶來一定的局限性。

3　miRNA

3.1miRNA作為潛在標志物的研究進展miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸[14]。成熟的miRNA形成RNA誘導的沉默復合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。不同的miRNA在不同肺癌類型中起不同的作用。有研究報道，在NSCLC中起到致癌作用的有miR-21、miR-17/92、miR-31、miR-224等，在NSCLC中起到抑癌作用的有l(wèi)et-7、miR-34b。miR-25在小細胞肺癌(SCLC)中起致癌作用，在SCLC中起抑癌作用的有miR-34、miR-138、miR-126。方楚玲等[15]綜述了miRNA對肺癌化療耐藥的調(diào)控，提出：miRNA與藥物轉(zhuǎn)運相關(guān)，如miR-495與順鉑藥物敏感性增加有關(guān)[16]；miRNA與細胞損傷后自我修復能力有關(guān)，如miR-138與ERCCL的mRNA結(jié)合導致順鉑敏感性增加[17]；miRNA調(diào)控細胞凋亡相關(guān)基因，如miR-135a與APC的mRNA結(jié)合，導致紫杉醇耐受[18]；miRNA與上皮細胞間質(zhì)化有關(guān)，如miR-200家族。在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNA表達模式具有分化的位相性和時序性，提示miRNA有可能作為參與調(diào)控基因表達的分子，因而具有重要意義。

3.2miRNA的檢測技術(shù)進展和臨床局限性miRNA常用的檢測技術(shù)有RT-PCR、miRNA芯片、Sanger測序、熒光原位雜交、基因敲除和過表達等方法。miRNA種類繁多，相同的miRNA在不同的腫瘤中都可能有異常表達，缺乏腫瘤異質(zhì)性和代表性，在臨床上使用上存在局限性。

4　外泌體

4.1外泌體作為潛在標志物的研究進展外泌體是細胞主動向胞外分泌的大小均一的囊泡樣小體,具有抗腫瘤免疫，促血管新生等生理功能[19]。不同類型的細胞可以釋放出外泌體。外泌體包含脂類、蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等[20]。外泌體可以用來做早期診斷、預(yù)后判斷、耐藥評估。腫瘤來源的外泌體促進腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移和耐藥[21]。Xiao等[22]認為抑制外泌體的形成和釋放可能是潛在的新的治療肺癌的策略。Rodriguez等[23]分析了外泌體中不同的miRNA。Frydrychowicz等[24]也認為認識外泌體和外泌體中的miRNA可能是認識肺癌的關(guān)鍵，為肺癌治療提供了新思路。外泌體能有效地保護核酸物質(zhì)且穩(wěn)定性好，克服ctDNA容易被降解的問題，可以用做ctDNA和miRNA的補充分析。

4.2外泌體的檢測技術(shù)進展和臨床局限性外泌體數(shù)量多于CTCs，更容易富集。常用檢測技術(shù)有免疫磁珠法、色譜法、動態(tài)光散射技術(shù)、納米微粒追蹤分析術(shù)等。目前，利用外泌體來研究NSCLC相對較少。其分離需要特殊設(shè)備，可分析的標志物相對較少，無法進行細胞層面的研究，有一定的臨床局限性。

5　小　　結(jié)

肺癌具有發(fā)病機制復制、早期難以發(fā)現(xiàn)等疾病特點，有效的、能夠用于早期發(fā)現(xiàn)的標志物的研究對肺癌治療十分必要。組織活檢是診斷肺癌的金標準，但具有創(chuàng)傷性和多次活檢的依從性較差的特點，而液體活檢無創(chuàng)且可以實時監(jiān)測。本綜述側(cè)重描述當前熱門的CTCs、ctDNA、miRNA、外泌體和其檢測技術(shù)的進展，同時分析了臨床局限性。為肺癌的精準醫(yī)療和個體化治療提供新的參考。液體活檢除了檢測CTCs、ctDNA、miRNA、外泌體之外，還可以檢測mRNA、IncRNA等。在檢測技術(shù)的不斷創(chuàng)新中，靈敏度不斷的提高，特別是新一代測序、擴增阻滯突變系統(tǒng)、ddPCR、熒光條形碼標記分子檢測技術(shù)等新技術(shù)，液體活檢這種無創(chuàng)傷的檢測將會成為檢驗科新的趨勢，也為精準醫(yī)學和個體化醫(yī)學提供新的研究參考。

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