郭　毅,楊靖嫻,邵冬華,劉　靜,梁國威

(北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)科，北京100049)

?

TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)光滑念珠菌

郭毅,楊靖嫻,邵冬華,劉靜,梁國威*

(北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)科，北京100049)

摘要：目的采用TaqMan-MGB探針作為檢測(cè)信號(hào)，建立快速檢測(cè)光滑念珠菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。方法以光滑念珠菌核糖體RNA編碼基因(rDNA)中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)作為靶基因，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan-MGB探針。在梯度光滑念珠菌純菌液標(biāo)本中評(píng)價(jià)所建方法靈敏度和重復(fù)性；在102株光滑念珠菌臨床分離株、非光滑念珠菌的其他4種念珠菌臨床分離株、7種細(xì)菌臨床分離株和人基因組的DNA中評(píng)價(jià)所建方法特異度；并在模擬光滑念珠菌血癥的血標(biāo)本中初步探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果所建方法對(duì)光滑念珠菌純菌液的檢測(cè)下限為101CFU/ml，相應(yīng)的批內(nèi)、批間變異系數(shù)(CV)分別為1.68%和2.84%。對(duì)102株光滑念珠菌臨床分離株檢出率為100%；對(duì)非光滑念珠菌無交叉反應(yīng)，顯示該方法特異性為100%。對(duì)模擬光滑念珠菌血癥血標(biāo)本的最低檢測(cè)下限為101CFU/ml。結(jié)論所建方法具有特異性和靈敏度高、重復(fù)性好的特性，適于臨床上光滑念珠菌血癥的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：光滑念珠菌；熒光定量PCR；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS 2) ；TaqMan-MGB探針；血流感染

(ChinJLabDiagn,2016,20:0178)

目前念珠菌中光滑念珠菌的臨床分離率僅次于白色念珠菌，可達(dá)到19%-26.7%[1，2]。由于光滑念珠菌對(duì)唑類抗真菌劑廣泛耐藥[3,4]，而且對(duì)棘白菌素和多烯類藥物不敏感的菌株也呈逐漸增多趨勢(shì)[5]，所以早期確診由光滑念珠菌引起血流感染對(duì)臨床診療具有重要的指導(dǎo)意義。

文獻(xiàn)顯示，多數(shù)PCR方法側(cè)重于針對(duì)念珠菌屬或者白色念珠菌菌種的檢測(cè)[6]，但對(duì)于光滑念珠菌的檢測(cè)方法則較為少見，而采用TaqMan-MGB探針作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)光滑念珠菌的方法未見報(bào)道。

因此，本研究的目的是以光滑念珠菌核糖體RNA編碼基因(rDNA)中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)作為靶基因，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan-MGB探針，建立光滑念珠菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料(1)標(biāo)準(zhǔn)菌株：光滑念珠菌 (ATCC 2001)1株，購自中國普通微生物菌種保藏中心；(2)臨床分離菌株：來自航天中心醫(yī)院微生物室菌種保存庫，包括102株光滑念珠菌、135株白色念珠菌、61株熱帶念珠菌、24株近平滑念珠菌、12株克柔念珠菌、24株大腸埃希菌、24株肺炎克雷伯菌、24株變形桿菌、24株粘質(zhì)沙雷菌、24株銅綠假單胞菌、24株鮑曼不動(dòng)桿菌以及24株金黃色葡萄球菌。以上菌株經(jīng)微生物鑒定儀(VitekⅡ，生物梅里埃公司，法國)鑒定確認(rèn)；(3)血液標(biāo)本10例，來自健康志愿者。

1.2臨床分離菌株及人基因組DNA提取(1)菌株DNA提?。翰捎脽嵝菘朔ㄌ崛【闐NA。具體步驟：菌懸液100℃加熱15 min，-80℃冷凍10 min，重復(fù)3次，12 000 r/min 離心15 min，上清即為菌株DNA粗提液，-80℃保存?zhèn)溆谩?2)人基因組DNA提取：按照血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，中國)操作步驟，從健康志愿者血液標(biāo)本中提取人基因組DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3光滑念珠菌梯度菌液配制和DNA提取(1)光滑念珠菌計(jì)數(shù)：采用改良牛鮑式血球計(jì)數(shù)板，按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程計(jì)數(shù)。(2)梯度菌液配制和提取：將光滑念珠菌(ATCC2001)計(jì)數(shù)后的107CFU/ml的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取稀釋后的菌液各100 μl，分別注入900 μl DNA提取液Ⅰ中(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司.中國)。按上述熱休克法提取DNA后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4光滑念珠菌梯度模擬感染血標(biāo)本的配制及其DNA提取(1)將光滑念珠菌(ATCC2001)計(jì)數(shù)后的107CFU/ml的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取稀釋后的菌液各100 μl，分別注入900 μl EDTA抗凝的健康人血液中，制成梯度模擬感染血標(biāo)本。(2)DNA提?。荷鲜鰳?biāo)本中加入500 μl細(xì)胞裂解液CL(天根生化科技有限公司，中國)，室溫10 min，12 000 r/min 離心15 min后棄上清；之后向沉淀加入1 ml Polaris細(xì)胞裂解液[7](500 mM Na2CO3和1% SDS)，室溫5 min，12 000 r/min離心15 min，棄上清。400 μl DNA提取液Ⅰ重懸沉淀后，按熱休克法提取DNA，上清液經(jīng)過濾柱，50 μl 洗脫，-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5引物和探針設(shè)計(jì)在Pubmed的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中檢索ATCC 2001光滑念珠菌ITS2序列(GenBank:JQ070075.1)，通過比對(duì)篩選種內(nèi)變異率小和種間特異性高的序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan-MGB探針。上游引物：5’- GCC ATA TCA GTA TGT GGG ACA CG-3’、下游引物5’-GTA TTA ACC CCC GCC GCT-3’，TaqMan-MGB探針：5’-VIC-CAA ACG AGC AGC AGA TTA AT-NFQMGB-3’，擴(kuò)增片段長度為80 bp。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)體系為20 μl，包括模板DNA 2 μl，上下游引物各2 μl(0.5 μmol/L)(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，中國)，TaqMan-MGB探針1 μl(0.25 μmol/L)(ABI公司，美國)，2.5×Master Mix 8 μl和20×Probe Enhancer solution 1 μl(天根生化科技有限公司，中國)，水1 μl。循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s 和60 ℃ 1 min，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。循環(huán)閾值(Ct值)設(shè)定在0.03，基線設(shè)定為自動(dòng)設(shè)定，測(cè)定儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。

2結(jié)果

2.1所建方法檢測(cè)靈敏度評(píng)價(jià)以梯度為106-101 CFU/ml的光滑念珠菌菌液提取的DNA為模板，對(duì)各水平DNA同時(shí)進(jìn)行10次PCR反應(yīng)，顯示皆有特異性擴(kuò)增曲線，其中101 CFU/ml 菌液所對(duì)應(yīng)的Ct值為34.89±0.59。顯示本方法最低可從101 CFU/ml的菌液中檢出光滑念珠菌，見圖1。濃度為106-101 CFU/ml純菌液標(biāo)本的PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率=-3.163，R2=0.990。

圖1光滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株純菌液梯度PCR擴(kuò)增曲線圖中6-1代表濃度為106-101 CFU/ml光滑念珠菌純菌液；NC代表陰性對(duì)照。

2.2所建方法檢測(cè)重復(fù)性評(píng)價(jià)對(duì)106-101CFU/ml 的光滑念珠菌各梯度菌液的DNA分別進(jìn)行10次批內(nèi)和批間的重復(fù)性檢測(cè)。批內(nèi)CV值的變化范圍為0.21%-1.68%，其中101CFU/ml對(duì)應(yīng)的V值最大(1.68%)。批間CV值的變化范圍為1.15%-2.84%，101CFU/ml濃度對(duì)應(yīng)的CV值最大(2.84%)，詳見表1。

表1　所建方法檢測(cè)各梯度菌液DNA的批內(nèi)、批間Ct值

2.3檢測(cè)方法特異度評(píng)價(jià)采用所建方法檢測(cè)不同來源DNA(具體目錄見本文“材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)材料”部分)，以評(píng)價(jià)其特異性。其中102株光滑念珠菌臨床分離菌株全部檢出(檢出率為100%)。其它非光滑念珠菌來源的DNA檢測(cè)結(jié)果均為陰性，顯示該方法對(duì)于檢測(cè)光滑念珠菌的特異度為100%。

2.4梯度念珠菌模擬感染血標(biāo)本檢測(cè)情況對(duì)含菌量為106-101CFU/ml的光滑念珠菌模擬感染血標(biāo)本DNA進(jìn)行檢測(cè)(平行重復(fù)3次)，結(jié)果顯示對(duì)于血流感染標(biāo)本的檢測(cè)下限為101CFU/ml(Ct值為37.87±1.05)，見圖2。含菌量106-101CFU/ml模擬感染血標(biāo)本的PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率=-3.26，R2=0.998。

圖2光滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株模擬感染血標(biāo)本擴(kuò)增曲線圖中6-1代表含菌量為106-101CFU/ml光滑念珠菌模擬感染血標(biāo)本，NC代表陰性對(duì)照。

3討論

本研究選擇光滑念珠菌rDNA基因中ITS2區(qū)作為擴(kuò)增靶序列，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan-MGB探針，成功建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)光滑念珠菌的方法。該方法對(duì)于光滑念珠菌純菌液的檢出下限為101CFU/ml，相應(yīng)批內(nèi)和批間變異率分別為1.68%和2.84%。特異性評(píng)價(jià)顯示，102株光滑念珠菌臨床分離株檢出率為100%，且與研究所納入的其它念珠菌、細(xì)菌以及人基因組DNA標(biāo)本無交叉反應(yīng)。另外，通過對(duì)模擬感染血標(biāo)本的檢測(cè)，證實(shí)該方法對(duì)于血流感染中光滑念珠菌的檢測(cè)下限也可達(dá)到101CFU/ml。

ITS2序列位于真核生物5.8S和28S rDNA之間，在種間高度特異[8]，可作為設(shè)計(jì)種特異性引物和探針的位點(diǎn)。本研究以光滑念珠菌 ATCC 2001菌株的ITS2序列作為比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)序列。首先，在Pubmed數(shù)據(jù)庫進(jìn)行種間序列比對(duì)(nucleotide blast)，顯示光滑念珠菌ITS2序列與人基因組、細(xì)菌庫、真菌庫、病毒庫、衣原體庫、支原體庫、立克次氏體庫皆無顯著重疊序列，特別是對(duì)于同光滑念珠菌表型、生化反應(yīng)等特性相似的C.nivariensis和C.bracarensis也能作出很好的區(qū)分。實(shí)際檢測(cè)結(jié)果也顯示本方法對(duì)光滑念珠菌以外的各種生物來源DNA皆無顯著性擴(kuò)增曲線。其次，進(jìn)行光滑念珠菌種內(nèi)ITS2序列比對(duì)，篩選種內(nèi)變異少的序列區(qū)間作為引物和探針的靶序列。通過對(duì)數(shù)據(jù)庫中的116條光滑念珠菌ITS2參考序列的比對(duì)，顯示本研究設(shè)計(jì)的引物和探針序列中均無種內(nèi)變異，據(jù)此計(jì)算的光滑念珠菌理論檢出率為100%。我們采用所建方法對(duì)102株光滑念珠菌臨床分離株進(jìn)行了檢測(cè)，檢出率為100%，未出現(xiàn)漏檢的情況。

TaqMan-MGB探針是在TaqMan探針3′端增加MGB (Minor Groove Binder，小溝結(jié)合物)修飾的一種水解探針，其特性包括：(1)顯著提高探針與模板結(jié)合的Tm值，15個(gè)堿基的探針可以提高 Tm 達(dá)18℃，允許設(shè)計(jì)更短的探針；(2)探針3′端-1 ～ -7位堿基內(nèi)的單一堿基錯(cuò)配可抑制探針與模板的結(jié)合，顯著提高探針特異性；(3)熒光本底低，提高信噪比[9]。利用上述特性，本研究設(shè)計(jì)的TaqMan-MGB探針長度為20 bp，除了避開了光滑念珠菌ITS2序列種內(nèi)堿基變異外，還同時(shí)增加了光滑念珠菌種間區(qū)分能力，提高了檢測(cè)特異度。在光滑念珠菌純菌液中，本方法的檢測(cè)下限可達(dá)到101CFU/ml，優(yōu)于Foongladda 等在18S rDNA上設(shè)計(jì)引物和采用普通水解探針的檢測(cè)結(jié)果(525 CFU/ml)[10]。而且濃度為101CFU/ml光滑念珠菌純菌液的批內(nèi)、批間的CV值分別為1.68%和2.84%，重復(fù)性良好，可滿足常規(guī)臨床要求(CV值<5%)。

血液中的血細(xì)胞成分是否完全去除可顯著影響PCR檢測(cè)的靈敏度。如有報(bào)道稱血紅素會(huì)造成DNA聚合酶的解離，從而影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行[11]；而白細(xì)胞的殘留也會(huì)使得大量人基因組DNA釋放到樣本中，干擾引物和探針與模板，特別是與低濃度模板的配對(duì)。本實(shí)驗(yàn)借鑒Loonen AJ[7]等人所采用的細(xì)胞裂解方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果等具體情況，改良出一套適合本實(shí)驗(yàn)室的紅細(xì)胞和白細(xì)胞去除流程，詳見“實(shí)驗(yàn)方法”中的(4)。實(shí)驗(yàn)顯示，我們對(duì)光滑念珠菌模擬感染的DNA檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到101CFU/ml，優(yōu)于Lehmann LE[12]等人采用高分辨溶解曲線原理所建立檢測(cè)方法(含菌量為102CFU/ml時(shí)，檢出率為100%；含菌量為30 CFU/ml時(shí)，檢出率為75%)，也優(yōu)于Roche公司SeptiFast試劑盒對(duì)于血流中光滑念珠菌的檢測(cè)下限(102CFU/ml)[13]。另外，與Loffler 等[14]所述紅、白細(xì)胞裂解法相比，還具有耗時(shí)短、成本低、試劑配制簡易等優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，本研究所述的基于光滑念珠菌ITS2序列，采用TaqMan-MGB探針作為檢測(cè)信號(hào)的熒光定量PCR方法，具有檢測(cè)靈敏度和特異性高，重復(fù)性好以及檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，顯著優(yōu)于臨床常規(guī)的血培養(yǎng)方法，適于臨床光滑念珠引起的血流感染的快速鑒定。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ericsson J,Chryssanthou E,Klingspor L,et al.Candidaemia in Sweden:a nationwide prospective observational survey[J].Clin Microbiol Infect,2013,19(4):E218.

[2]Pfaller M,Neofytos D,Diekema D,et al.Epidemiology and outcomes of candidemia in 3648 patients:data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH Alliance(R)) registry,2004-2008[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2012,74(4):323.

[3]Wisplinghoff H,Ebbers J,Geurtz L,et al.Nosocomial bloodstream infections due to Candida spp.in the USA:species distribution,clinical features and antifungal susceptibilities[J].Int J Antimicrob Agents,2014,43(1):78.

[4]Taj-Aldeen SJ,Kolecka A,Boesten R,et al.Epidemiology of candidemia in Qatar,the Middle East:performance of MALDI-TOF MS for the identification of Candida species,species distribution,outcome,and susceptibility pattern[J].Infection,2014,42(2):393.

[5]Dudiuk C,Gamarra S,Leonardeli F,et al.Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS genes linked with echinocandin resistance.J Clin Microbiol,2014,52(7):2609.

[6]Schell WA,Benton JL,Smith PB,et al.Evaluation of a digital microfluidic real-time PCR platform to detect DNA of Candida albicans in blood[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2012,31(9):2237.

[7]Loonen AJ,Bos MP,van Meerbergen B,et al.Comparison of pathogen DNA isolation methods from large volumes of whole blood to improve molecular diagnosis of bloodstream infections[J].PLoS One,2013,8(8):e72349.

[8]Lott TJ,Kuykendall RJ，Reiss E.Nucleotide sequence analysis of the 5.8S rDNA and adjacent ITS2 region of Candida albicans and related species[J].Yeast,1993,9:1199.

[9]Kutyavin IV,Afonina IA,Mills A,et al.3’-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures[J].Nucleic Acids Res,2000,28:655.

[10]Foongladda S,Mongkol N,Petlum P,et al.Multi-probe real-time PCR identification of four common Candida species in blood culture broth[J].Mycopathologia,2014,177(5-6):251.

[11]Gosiewski T,Brzychczy-Wloch M,Pietrzyk A,et al.Evaluation of the activity of thermostable DNA polymerases in the presence of heme,as a key inhibitor in the real time PCR method in diagnostics of sepsis[J].Acta Biochim Pol,2013,60(4):603.

[12]Lehmann LE,Hunfeld KP,Emrich T,et al.A multiplex real-time PCR assay for rapid detection and differentiation of 25 bacterial and fungal pathogens from whole blood samples[J].Med Microbiol Immunol,2008,197(3):313.

[13]Westh H,Lisby G,Breysse F,et al.Multiplex real-time PCR and blood culture for identification of bloodstream pathogens in patients with suspected sepsis[J].Clin Microbiol Infect,2009,15(6):544.

[14]Loffler J,Hebart H,Schumacher U,et al.Comparison of different methods for extraction of DNA of fungal pathogens from cultures and blood[J].J Clin Microbiol,1997,35(12):3311.

Rapid detection ofCandidaglabrataby using a TaqMan-MGB probe-based quantitative real-time PCR assayGUOYi,YANGJing-xian,SHAODong-hua,etal.(DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUniversityAerospaceSchoolofClinicalMedicine，Beijing100049,China)

Abstract:ObjectiveTo develop a TaqMan-MGB probe-based quantitative real-time PCR assay for rapid identification ofCandidaglabrata(C.glabrata).MethodsThe internal transcribed spacer 2 (ITS2) on ribosomal DNA (rDNA) ofC.glabratawas used as a target for designing specific primers and TaqMan-MGB probe.The sensitivity and reproducibility of the present method were evaluated with serial diluted samples ofC.glabrata.The specificity of the method was validated in DNA samples from clinical isolates of 102 strains ofC.glabrata,4 other species of non-glabrataCandida,7 species of bacteria and human blood specimen,respectively.We also evaluated the clinical application values of the assay using simulatedC.glabratacandidemia in blood samples.ResultsThe lowest counts ofC.glabratathat the assay can measure accurately was 101CFU/ml,and its coefficients of variability (CV) of intra-assay and inter-assay were 1.68% and 2.84%,respectively.The detectable rate was 100% for 102 clinical isolates ofC.glabrata.No cross reaction by the assay were observed indicating the specificity was 100%.For simulated infection blood samples,the detection limit ofC.glabratawas 101CFU/ml by the assay.ConclusionThe newly developed method was a highly sensitive and specific assay,which could be applied to rapid diagnosis of bloodstream infections induced byC.glabrata.

Key words:Candidaglabrata;Real-time PCR;Internal Transcribed Spacer 2(ITS2);TaqMan-MGB probe;Bloodstream infections

(收稿日期：2015-11-10)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：Q78

文章編號(hào)：1007-4287(2016)02-0178-04

*通訊作者

基金項(xiàng)目：北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院科研基金(YN201322)