李曉華，劉　凱，張　寧，李世文，高海成，苗春生*，尹殿勝

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021;3.吉林消防總隊(duì)醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130061)

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大小劑量鹽酸異丙腎上腺素誘發(fā)大鼠心肌損傷模型的研究

李曉華1，劉凱2，張寧2，李世文2，高海成2，苗春生2*，尹殿勝3

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021;3.吉林消防總隊(duì)醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130061)

摘要：目的探究大劑量鹽酸異丙腎上腺素(ISO，15 mg/kg)與小劑量鹽酸異丙腎上腺素(3 mg/kg)誘發(fā)大鼠心肌損傷模型，闡明心肌損傷程度，為本科教學(xué)提供好的模具。方法Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組，ISO-2h (15 mg/kg)；ISO-3 weeks (15 mg/kg)；ISO-2h (3 mg/kg)；ISO-3weeks (3 mg/kg) 。除正常組外，其余各組大鼠皮下多點(diǎn)一次性分別注射ISO 15 mg/kg和3 mg/kg。通過(guò)死亡率，形態(tài)學(xué)及膠原的表達(dá)比較兩種劑量模型的損傷程度。結(jié)果注射15 mg/kg ISO，心肌在2 h即出現(xiàn)較大的點(diǎn)狀壞死，3周出現(xiàn)明顯的纖維化，大鼠死亡率亦較低；注射3 mg/kg ISO，心肌在2 h出現(xiàn)少量點(diǎn)狀壞死，3周出現(xiàn)纖維增生。結(jié)論多點(diǎn)皮下一次性注射ISO 15 mg/kg較注射ISO 3 mg/kg病灶清晰，可出現(xiàn)明顯的纖維化，為本科教學(xué)提供較好的模具。

關(guān)鍵詞：鹽酸異丙腎上腺素；心肌損傷；動(dòng)物

(ChinJLabDiagn,2016,20:0185)

文獻(xiàn)報(bào)道，ISO 可引發(fā)大鼠心肌損傷[1，2]，該損傷能夠評(píng)價(jià)藥物抑制心肌損傷模型[3，4]。以往多注射 ISO 2 mg/kg-5 mg/kg 誘發(fā)心肌損傷[5-7]，其最高劑量也不過(guò)10 mg/kg[8]。隨能誘發(fā)心肌損傷，但很難達(dá)到判定早期心肌損傷的程度和較好地運(yùn)用本科教學(xué)。我室曾用3 mg/kg ISO誘發(fā)大鼠心肌損傷模型，其成模率較低，且程度較輕。因此，構(gòu)建結(jié)構(gòu)清晰的心肌損傷模型，成為科學(xué)人員迫切解決的問(wèn)題。我室摸索出多點(diǎn)皮下一次性注射15 mg/kg ISO，死亡率較3 mg/kg ISO無(wú)明顯增高，病變程度明顯優(yōu)于3 mg/kg ISO誘導(dǎo)的心肌模型，且出現(xiàn)明顯的纖維化。由此，大劑量ISO誘發(fā)心肌損傷模型明顯優(yōu)于小劑量ISO誘發(fā)大鼠心肌損傷模型，為本科教學(xué)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性(Wistar)大鼠30只，體重180-220 g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要儀器與試劑萊卡切片機(jī)(德國(guó))；0.9%生理鹽水注射液；ISO注射液由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)。(濃度1 mg/2 ml)

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型的建立30只(Wistar)大鼠分成ISO組和正常對(duì)照組(兩組)。ISO 2 h、3 w組(皮下多點(diǎn)一次性注射ISO 15 mg/kg)。ISO 2 h、3 w ((皮下多點(diǎn)一次性注射ISO 3 mg/kg)

1.3.2HE染色取材經(jīng)10%甲醛固定30 min，常規(guī)石蠟包埋。用二甲苯脫臘10 min，用100%乙醇置換二甲苯2 min、95%乙醇置換1 min、80%乙醇置換1 min及用75%乙醇置換1 min，蒸餾水沖洗 2 min。蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗。鹽酸乙醇分化30 s。自來(lái)水浸泡15 min。伊紅染2 min。常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封閉劑封片。

1.3.3Masson 三色染色切片常規(guī)脫蠟至水。蘇木素染核2 min，流水沖洗。麗春紅品紅液染5 min，顯微鏡下控制。0.5%冰醋酸水溶液快速?zèng)_洗。1%磷鉬酸水溶液快速處理，其切片由深紅色至鮮紅色至粉紅色，其顏色的掌握度必須在顯微鏡下控制。直接用苯胺藍(lán)染色。0.5% 冰醋酸水溶液快速?zèng)_洗。常規(guī)脫水，二甲苯透明，封片。

2結(jié)果

2.1HE染色(小劑量)

在正常組中，心肌排列整齊，橫紋清晰，胞核明顯，無(wú)細(xì)胞腫脹(圖1A)。注射ISO2h后，心尖及心內(nèi)膜僅有少量的變性和水腫，局限于心內(nèi)膜下(圖1B)。注射ISO3w后，出現(xiàn)局部小壞死病灶，局部出現(xiàn)增生組織(圖1C)。

A:正常對(duì)照組；B：注射ISO-2h組；C：注射ISO-3周組

2.2Masson三色染色(小劑量)

在正常組中，僅見(jiàn)少量膠原蛋白；注射ISO2h后，膠原蛋白含量增加P<0.05；隨注射時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白含量有所增加P<0.01，且壞死面輪廓較輕(圖2)。

A:正常對(duì)照組；B：注射ISO-2h組；C：注射ISO-3周組

2.3HE染色(大劑量)在對(duì)照組中心肌排列整齊，橫紋清晰，胞核明顯(圖3A)。注射ISO2h后，心內(nèi)膜即有明顯的變性和水腫，且出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死(圖3B)。注射ISO3w后，壞死面積達(dá)到最大，病灶內(nèi)出現(xiàn)明顯的纖維化(圖3C)。

A:正常對(duì)照組；B：注射ISO-2h組；C：注射ISO-3周組

2.4Masson三色染色(大劑量)

在正常組中，僅見(jiàn)少量膠原蛋白；注射ISO2h后，膠原蛋白表達(dá)量明顯增加P<0.05； 3周時(shí)膠原蛋白含量增加明顯P<0.01，壞死面輪廓清晰可見(jiàn)圖4。

3討論

隨著人口老齡化的增加，現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，飲食習(xí)慣的改變以及社會(huì)、心理等因素的影響，我國(guó)心血管疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)[5]。因此，探究心血管疾病已成為當(dāng)前研究的熱門(mén)話題。由此建立心肌損傷模型便成為研究的首要問(wèn)題，當(dāng)前通過(guò)尾加壓素強(qiáng)烈收縮冠狀動(dòng)脈作用引起心肌缺血壞死；注射兒茶酚胺類(lèi)藥物促進(jìn)冠狀動(dòng)脈收縮、增強(qiáng)心肌收縮力和增加心肌耗氧量等多方面機(jī)制誘發(fā)心肌缺血壞死。其中，兒茶酚胺類(lèi)藥物誘導(dǎo)的心肌缺血壞死模型具有方法簡(jiǎn)單、時(shí)間易于掌握、效果穩(wěn)定可靠、心肌缺血壞死的病理特點(diǎn)和發(fā)生機(jī)制與人類(lèi)缺血性心肌缺血壞死有較多類(lèi)似之處等優(yōu)點(diǎn)，故我室選擇多點(diǎn)皮下一次性注射ISO的方法[3]。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)探究，劑量為3mg/kgISO方法復(fù)制的大鼠心肌缺血壞死模型，結(jié)果表現(xiàn)為病變輕微及病變發(fā)生時(shí)間較為分散，很難捕捉早期病變的出現(xiàn)時(shí)間和病變情況。為捕捉早期心肌缺血壞死灶內(nèi)的病變過(guò)程和細(xì)胞變化情況，我室參考了以往實(shí)驗(yàn)劑量[5-8]，但其病變結(jié)果未出現(xiàn)纖維化。為引起病變后纖維化，我室摸索出注射15 mg/kg ISO誘發(fā)心肌損傷模型，注射ISO 2 h后，心肌表現(xiàn)為變性、水腫及較重的點(diǎn)狀壞死，隨注射時(shí)間的延長(zhǎng)缺血壞死面積明顯增加，3w達(dá)高峰，且出現(xiàn)明顯的纖維化，提示注射15 mg/kg ISO可成功地復(fù)制大鼠心肌損傷模型。而注射3 mg/kg ISO大鼠心肌組織出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死和增生，但很難達(dá)到教學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。由此注射15 mg/kg ISO能為本科教學(xué)提供有效效的模具。

A:正常對(duì)照組；B：注射ISO-2 h組；C：注射ISO-3周組

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Study on large and small dose of Isoprenaline induced the model of myocardial injury of ratsLIXiao-hua1,LIUKai2,ZHANGNing2,etal.(1.TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041，China；2.CollegeofPharmacy,JilinUniversity；3.HospitalofJilinFireFighting,Changchun130061,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the model on large dose of Isoprenaline Hydrochloride (15 mg/kg) and small dose of Isoprenaline Hydrochloride (3mg/kg)-induced myocardial injury.To clarify the degree of myocardial injury,and provide good mould for undergraduate teaching.Methods30 Wistar male rats were randomly divided into 6 groups,control group (two groups),ISO-2h (15 mg/kg),ISO-3weeks (15 mg/kg),ISO-2h (3mg/kg),ISO-3weeks (3mg/kg).In addition to normal group,the other rats were injected with ISO 15 mg/kg and 3 mg/kg,respectively.The damage degree of the model was determined by morphology and Masson staining.Resultsthe myocardium appeared necrosis after injection 15 mg/kg ISO in 2h and appeared the fibrosis at 3 weeks,the mortality of rats was lower.The myocardial tissue had a small amount of necrosis after injection ISO in 2h and appeared fiber hyperplasia.ConclusionThe model of myocardial injury in injection 15 mg/kg ISO was clearer than the injection of 3 mg/kg,which could appear obvious fibrosis,could provide better mould for undergraduate teaching.

Key words:ISO;Myocardial injury;Animal

(收稿日期：2015-08-20)

作者簡(jiǎn)介：李曉華，吉林大學(xué)第二醫(yī)院；苗春生，吉林大學(xué)藥學(xué)院，主要從事心血管方面的研究。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：Q617

文章編號(hào)：1007-4287(2016)02-0185-04

*通訊作者

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳資金資助課題(YYZX201259，20140312002ZG)；吉林大學(xué)項(xiàng)目基金(409020720084)