孫茂鋼， 鄧　雯， 趙厚育

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽　550004; 2.貴州醫(yī)科大學附院 耳鼻咽喉科， 貴州 貴陽　550004)

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·特約專論·

納米包被siRNA復(fù)合體在抗癌治療中的應(yīng)用*

孫茂鋼1， 鄧雯1， 趙厚育2**

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽550004; 2.貴州醫(yī)科大學附院 耳鼻咽喉科， 貴州 貴陽550004)

[關(guān)鍵詞]乙烯亞胺-四氧化三鐵； 磁性納米粒； 基因轉(zhuǎn)染； 鼻咽癌； 缺氧誘導(dǎo)因子- 1α； 信使RNA

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是在研究新小桿線蟲雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)介導(dǎo)的基因出現(xiàn)表達抑制時首次被發(fā)現(xiàn)的，但由于這樣的基因沉默是系統(tǒng)性的，當時有假設(shè)RNAi的效應(yīng)是由一些穩(wěn)定的中間媒介所調(diào)控的[1]，后來才有更進一步的研究發(fā)現(xiàn)了這些中間媒介,例如dicer酶和RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)[2],RISC是由一系列蛋白和siRNA小分子組成的化合物，其中高度保守的Argonaute蛋白AGO2是組成RISC酶促反應(yīng)的中心。雙鏈互補的siRNA和信使RNA(message RNA，mRNA)的相互作用構(gòu)成了RNAi的核心內(nèi)容[3]。裸siRNA因其物理化學的一些特性限制了其在臨床中的應(yīng)用，近年來人們發(fā)現(xiàn)納米顆粒包被的siRNA彌補了裸siRNA的不足，且進一步臨床試驗逐漸展開，本文對納米包被siRNA復(fù)合體在抗腫瘤治療中的應(yīng)用進展進行報道。

1siRNA的特點

基因沉默的發(fā)生主要通過兩個階段來實現(xiàn)，即轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS)和轉(zhuǎn)錄基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)[1，4]。PTGS的機制主要分為兩類，直接的序列特異性切割以及RNA降解。siRNA和目的mRNA序列的完美互補會引發(fā)由RISC介導(dǎo)的序列特異性的切割，通過RNA降解而引起的轉(zhuǎn)錄抑制通常由多種miRNA調(diào)節(jié)，且當siRNA和靶mRNA的序列并不完全互補時，通過這一機制也可引起基因沉默效應(yīng)[5]。siRNA可以被轉(zhuǎn)染到細胞中并結(jié)合到RISC的發(fā)夾結(jié)構(gòu)上而啟動RISC導(dǎo)致基因沉默的機制，即作為向?qū)椭R別所要沉默的目標基因序列[5]。人工合成的siRNA大約有22個核苷酸，在其3′端掛有二核苷酸模擬dicer酶切產(chǎn)物，以便更好的與RISC結(jié)合。人工合成的siRNA因其提升了基因沉默的穩(wěn)定性與沉默效率，加之化學合成siRNA過程中可以人為設(shè)計從而避免免疫原性以及降低與mRNA的錯配，使siRNA應(yīng)用到基因治療中一直被看好[5-6]。由于RNAi的這些特性，近年來越來越多的用于癌癥的基因治療，例如靶向沉默一些導(dǎo)致細胞無限增殖的基因，如周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin denpendent kinases,CDKs)、胰島素樣生長因子(insulin growth factor，IGF)、血管生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和諸多抗凋亡的因子。

2納米粒及其與siRNA結(jié)合的優(yōu)勢

納米粒是直徑在1～100 nm之間不等的原子或小分子聚合而成[7]，納米粒作為載體最有優(yōu)勢的地方在于其無免疫原性[8]。通常納米顆粒分為：無機納米顆粒和有機納米顆粒兩大類。但是無機納米顆粒常常包裹著有機材料，就像上述的為了提升納米顆粒水溶性而加載的多聚體。另外也有不同于此兩類的納米顆粒的存在，此類納米顆粒通常是復(fù)雜的多種多聚體聚合而成，同時兼有無機納米顆粒和有機納米顆粒的特征[9-10]。一些納米顆粒的軛合物，例如SMANCS(styrene maleic acid neocarzinostatin)在小鼠中發(fā)現(xiàn)其具有多種免疫調(diào)節(jié)的作用，它能刺激巨噬細胞的生成，而巨噬細胞的增多一方面可使體內(nèi)干擾素γ的產(chǎn)生增多，另一方面使自然殺傷(natureal killer，NK)細胞增多，這兩者的升高使體內(nèi)抗腫瘤免疫機制得到更進一步的活化。納米顆粒中的一類陰離子聚合物亦有報道稱其具有介導(dǎo)干擾素類和多種細胞因子的生成。因其特性，納米顆粒也可選擇性的穿過腫瘤細胞膜進入且在其中聚集。這種選擇性賦予了納米顆粒在體內(nèi)研究具有獨特的優(yōu)點，在最小程度降低副作用的情況下提高轉(zhuǎn)染的效率，且在轉(zhuǎn)染后通過一定的手段能夠定位納米顆粒從而在體內(nèi)研究中追蹤所轉(zhuǎn)染siRNA或傳送藥物的位置[11]。

裸siRNA因其物理化學的一些特性限制了其在臨床中的應(yīng)用，siRNA的大分子量加之其多陰離子的特性使其不易被細胞被動攝取，細胞外的屏障更加大了siRNA進入細胞的難度[9],較差的水溶性很大程度的限制了新興藥物在臨床上的應(yīng)用，siRNA和具有水溶性的納米顆粒結(jié)合以后能夠借助其獲得相應(yīng)程度的水溶性。另一方面，許多納米顆粒的疏水性也可以通過連接一個親水的多聚體得到解決。這能夠改善納米顆粒的穩(wěn)定性，從而使siRNA的應(yīng)用可以在小腸和口腔能夠被更好的吸收[11]。

要將完整的siRNA通過靜脈注射進入體內(nèi)而實現(xiàn)沉默靶基因的作用必須借助納米顆粒等保護siRNA，使siRNA免受血漿核酸酶的降解從而有效及高效的將siRNA導(dǎo)入體內(nèi)。裸siRNA在血漿核酸酶的作用下，30 min即可完全降解，提示將siRNA包裹到惰性的納米顆粒中即可使siRNA免受機體血漿核酸酶的作用[3，12]。機體的固有免疫系統(tǒng)負責識別和清除就像納米顆粒這類的進入機體的外來物質(zhì)。單核巨噬細胞系統(tǒng)(mononuclear phago-cyte system，MPS)包繞在器官如肝、脾、腎的周圍，MPS對納米顆粒在體內(nèi)的藥物代謝動力學起到了決定性的作用。肝臟就像一個篩子，利用其富集著單核細胞或巨噬細胞的區(qū)域過濾血液以及清除細胞碎片、細菌或者就像納米顆粒這樣的外來小分子，腎臟則幫助清除這些肝臟過濾后的物質(zhì)。要避免肝臟的代謝需要在納米顆粒上進行一些調(diào)整，例如藥物蛋白修飾，將聚二乙醇分子PEG附著到所治療的蛋白上(PEGylation)，再附著到納米顆粒上即可降低肝臟對納米顆粒的識別和過濾同時增加納米顆粒在體內(nèi)的半衰期。要避免腎臟的清除需要在納米顆粒的粒徑及電荷上做調(diào)整，納米粒徑大于8 nm且?guī)в休^多陰離子的顆粒比較不容易從腎臟中排泄[3，13]。另外，帶有配合基的納米顆粒能夠更好的進行識別，使siRNA導(dǎo)入到腫瘤細胞中[14]。

作為將siRNA導(dǎo)入細胞或體內(nèi)的載體介質(zhì)，不管其在細胞層面或是全身系統(tǒng)性的引起不可接受的毒性反應(yīng)都會被排除作為基因治療載體的可能性。細胞毒性可以通過染色的實驗結(jié)果得以鑒別，根據(jù)活細胞的數(shù)量，染色后可判斷載體給細胞帶來多少程度的毒性[15-16]。過去常用來投遞siRNA的載體為病毒載體，但是病毒載體可刺激機體對其的免疫反應(yīng)從而帶來一系列細胞毒性，后來人工合成的脂類以及納米多聚體類載體才被設(shè)計用來替代病毒作為將siRNA投遞到細胞內(nèi)或者體內(nèi)的介質(zhì)。機體可通過生物降解將大分子多聚體類物質(zhì)分解并排泄，正是由于這種生物降解的能力，帶有連桿結(jié)構(gòu)的大分子聚合物可以被分解從而降低其產(chǎn)生的細胞毒性,殼聚糖多聚體納米顆粒在體內(nèi)的生物降解就是其中一個例子[4]。內(nèi)吞運動是真核生物中通過質(zhì)膜變形內(nèi)陷而將外來物質(zhì)運入細胞內(nèi)的過程，外源物質(zhì)進入細胞內(nèi)的經(jīng)典的路徑是通過受體配體識別而進入，進入細胞內(nèi)的物質(zhì)會被內(nèi)涵體捕獲，繼而被溶酶體所分泌的酸性物質(zhì)進一步降解。溶酶體中的酶一旦釋放，siRNA即會被降解。所以找到一種替代方法，使納米顆粒進入細胞時避開這種通路是很有必要的，其中一種不同于受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用為胞飲作用，胞飲雖然為非特異性的，但通過這種途徑進入細胞內(nèi)的納米顆粒可以避免溶酶體分泌的酸性物質(zhì)對其的降解[17-18]。

3納米包被siRNA復(fù)合體在臨床實驗中的研究進展

Ⅰ期臨床實驗包括初步的臨床藥理學、人體安全性評價試驗及藥代動力學試驗，為制定給藥方案提供依據(jù)。包括耐受性試驗：初步了解試驗藥物對人體的安全性情況，觀察人體對試驗藥物的耐受及不良反應(yīng)。藥代動力學試驗：了解人體對試驗藥物的處置，即對試驗藥物的吸收、分布、代謝、消除等情況。Ⅱ期臨床實驗為治療作用初步評價階段，其目的是初步評價藥物對目標適應(yīng)癥患者的治療作用和安全性，也包括為Ⅲ期臨床試驗研究設(shè)計和給藥劑量方案的確定提供依據(jù)。Ⅲ期臨床實驗為治療作用確證階段，其目的是進一步驗證藥物對目標適應(yīng)癥患者的治療作用和安全性，評價利益與風險關(guān)系，最終為藥物注冊申請的審查提供充分的依據(jù)。Ⅳ期臨床實驗是為新藥上市后由申請人進行的應(yīng)用研究階段，其目的是考察在廣泛使用條件下的藥物的療效和不良反應(yīng)、評價在普通或者特殊人群中使用的利益與風險關(guān)系以及改進給藥劑量等。作為一種新興科技，siRNA以一種空前的速度進入了臨床實驗的研究中。盡管許多抗腫瘤的新型藥物尚不能進入日常臨床應(yīng)用中，還是可以看到一些令人欣慰的新藥物的出現(xiàn)，拮抗bcl2基因的小片段序列雖然因為可能治療效率不高未通過美國食品藥品監(jiān)督局的批準進入臨床實驗，但其在治療慢性淋巴性白血病中仍然是一個十分有前景的治療備選[3]。環(huán)式糊精在臨床上的應(yīng)用研究已經(jīng)到了臨床Ⅰ～Ⅱ期實驗，CALAA-01是第一個在人類身上運用納米顆粒包載siRNA系統(tǒng)使用的環(huán)式糊精多聚體復(fù)合物，Ⅰ期臨床實驗主要應(yīng)用在實體瘤病人身上，具體來說就是將拮抗核糖核酸還原酶亞單位M2(RRM2)的siRNA包被到納米顆粒中經(jīng)靜脈注射到病人體內(nèi)，從而啟動內(nèi)源性RNAi機制而使靶基因的mRNA水平下降[19]。如今，CALAA-01的Ⅰ期臨床實驗已經(jīng)進行到安全性研究及對人體合適劑量的選擇[20]。

細胞毒性是此類治療載體在應(yīng)用到臨床之前最重要的評估因素。在小鼠模型中，一些炎癥趨化因子如白介素6、白介素12及γ干擾素，以及肝毒性標志物例如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶被用來衡量納米顆粒進入機體可能帶來的毒性反應(yīng)。納米顆粒包被的沉默GC4基因的siRNA復(fù)合體的體內(nèi)實驗中，所測試到機體中白介素6、白介素12及γ干擾素并未有統(tǒng)計意義上的提高，且天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶相比于未處理組來說也未有提高[21-22]。為了了解納米顆粒應(yīng)用到體內(nèi)實驗的治療結(jié)果，在肺癌小鼠模型上進行了實驗，一組為納米顆粒包被的干擾siRNA為實驗組，納米顆粒包被的對照siRNA為對照組，連續(xù)的靜脈注射到小鼠體內(nèi)。當納米顆粒包被的干擾siRNA持續(xù)注射到小鼠體內(nèi)后，惡性細胞的生長被抑制，觀察到小鼠肺中的惡性結(jié)節(jié)停止了生長，與對照組相比，腫瘤的直徑縮小了約30%。蘇木精伊紅染色也確定了實驗組的小鼠肺中惡性細胞數(shù)減少，腫瘤大小比對照組小，且具有統(tǒng)計學意義[21-22]。亦有另外的體內(nèi)實驗同樣用來驗證納米顆粒包載的siRNA在體內(nèi)的治療效果，抗凋亡基因Bric5是編碼凋亡抑制家族中一員Survivin的其中一個基因，將沉默Bric5的siRNA包被到納米顆粒中注射到體內(nèi)，通過RT-PCR檢測Survivin的mRNA表達量比對照組低97.2%，另外，與腫瘤相關(guān)的凋亡及細胞壞死都顯著低于對照組。靜脈注射有機納米顆粒包被10mgsiRNA到前列腺腫瘤模型的小鼠中，觀察到腫瘤大小減小了約92%[3，23]。將沉默bcl2基因家族成員的siRNA包被到聚乙烯乙二醇(PEG)納米顆粒中靜脈注射到體內(nèi)，觀察到肺部腫瘤的生長被抑制了40%～65%[24]。靜脈注射包被了拮抗血管生因子VEGF的siRNA的納米顆粒后，前列腺的皮下腫瘤體積縮小了53%～87%[25]。

4納米粒在臨床應(yīng)用中的缺陷

過多的生物積累是限制納米顆粒作為載體在體內(nèi)甚至在臨床應(yīng)用中受到限制的因素之一。要減少或避免生物積累需要對其半衰期以及所使用的多聚體的代謝途徑有深入了解。納米顆粒中所使用的基本的多聚體單元需要保證能夠被生物降解或者大小要比腎臟分泌閾值(<40 kDa)更小。納米顆粒中若使用的是疏水性的多聚體，則其通常會通過膽汁分泌而被排泄出體外，當然，也不能忽略這一類的多聚體會因為有皮下脂肪的存在而長期存留于皮下。因此，在使用納米顆粒作為載體時，運用哪一種多聚體及用量是值得深思熟慮的[11]。

攜帶抗癌藥物或基因小片段的納米載體在進入體內(nèi)后，可能如同石棉一般引起機體的間皮瘤，這是因為其所攜帶的抗癌小片段在有水的情況下，包括血漿以及組織液等，會產(chǎn)生含氧自由基。另外，通過靜脈注射進入體內(nèi)的納米顆粒因其物理特性及人體解剖特點，會存留在肺中。當然，前述只是為個別例子，仍然有大量可人工合成的安全的多聚體可作為合成納米顆粒的備選，但無疑，在進一步發(fā)展納米顆粒作為載體在體內(nèi)的應(yīng)用時，需要考慮它的最終代謝途徑以及納米顆粒進入機體后所存留的部位[11，26]。

5展望

盡管siRNA是相對比較新的技術(shù)，但已被驗證其可以用來作為大批疾病的治療方案之一；盡管siRNA作為治療方法許多難題已被攻克，但在其可以應(yīng)用到日常臨床治療方案的路上仍有許多困難需要被克服。以siRNA為基礎(chǔ)的治療能應(yīng)用到體內(nèi)，則其轉(zhuǎn)運載體所要達到的終極目標是安全性、有效性、可靠性，熟知納米顆粒的特性及其在機體中的運行代謝方式，無疑可以為推進siRNA在體內(nèi)的應(yīng)用添磚加瓦。

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(2016-01-12收稿，2016-04-05修回)

編輯： 劉平

[中圖分類號]R34-33； R739.6

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0373-04

*[基金項目]國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目(NO.81260353)

**通信作者 E-mail:zhaohouyujia@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1746.004.html