房小凱 孫青

遺傳性泛發(fā)性色素異常癥遺傳學研究進展

房小凱 孫青

遺傳性泛發(fā)性色素異常癥以常染色體顯性遺傳模式為主，也可表現為常染色體隱性遺傳。近年來該病的分子遺傳學研究取得較大進展，找到3個不同致病區(qū)域，分別為6q24.2-q25.2、12q21-q23和2q35。發(fā)現2q35上的ATP結合盒亞家族B成員6為該病的致病基因，進一步通過基因功能證實，免疫組化顯示，ABCB6抗體在上皮細胞質中彌散性分布，蛋白免疫印跡顯示，ABCB6在黑素細胞和角質形成細胞中有表達，斑馬魚實驗證明了ATP結合盒亞家族B成員6在色素代謝方面起重要作用。目前報道，遺傳性泛發(fā)性色素異常癥的ABCB6基因突變位點共8個，包括1個移碼突變，7個錯義突變。

細胞遺傳學；基因，ABCB6；突變；遺傳異質性；遺傳性泛發(fā)性色素異常癥

遺傳性泛發(fā)性色素異常癥（DUH）是一種常染色體顯性遺傳性皮膚病，常于嬰兒期或幼兒早期發(fā)病，表現為分布軀干和四肢的泛發(fā)性色素沉著斑和減退斑，有時可累及面部，斑片大小不一、形狀不規(guī)則，一般無瘙癢或疼痛，可伴發(fā)血小板減少［1］和結節(jié)性硬化［2］等疾病。在不同種族家系中，DUH的致病區(qū)域曾分別被定位于 6q24.2-q25.2［3］、12q21-q23［4］、2q35［5］上，近期其致病基因被證實為2q35上的ATP結合盒亞家族B成員6（ABCB6）。

1 DUH致病基因定位與克隆

DUH病例在世界各個地區(qū)均有報道，其中亞洲的病例較多。DUH大多呈常染色體顯性遺傳模式，在中國、日本和印度等國家多有報道［3，6］，但在沙特阿拉伯［4］和印度［7］等地區(qū)曾報道過常染色體隱性遺傳的 DUH 家系，同時在突尼斯［8］、高加索地區(qū)［9］、非裔美州人中［10］和亞洲大部分地區(qū)［11］均有散發(fā)病例，其中不乏父母為近親結婚的病例。

1.1 致病基因定位于6q24.2-q25.2區(qū)域：2003年，Xing等［3］研究了兩個中國遺傳性對稱性色素異常癥（DSH）家系，患者表現為面頸部、軀干和四肢大小不同的色素沉著和減退斑，利用連鎖分析方法，在6q24.2-q25.2上的10.2 Mb區(qū)間內發(fā)現最大LOD值10.64，認為該區(qū)域是DSH的致病區(qū)域。Miyamura等［12］認為，Xing 等［3］研究的患者實際上是 DUH 患者，因為患者幾乎全身皮膚都有色素異常斑，其皮損特征符合DUH的臨床特點，同時將DSH致病基因定位于1q21.3上的ADAR基因。6q24.2-q25.2被認為是最早確定的DUH致病區(qū)域。

1.2 致病基因定位于12q21-q23區(qū)域：Stuhrmann等［4］對一個具有4例患者和3例健康個體的沙特阿拉伯DUH家系進行一項以區(qū)分DUH與DSH為目的的研究時，在排除DSH的致病基因ADAR基因突變以后，通過以單核苷酸多態(tài)性（SNP）為基礎的全基因組關聯研究，在常染色體隱性遺傳模式下，確定了導致該病的新致病區(qū)域為位于rs1921045和rs2373584之間的12q21-q23區(qū)域，最大LOD值為3.4，區(qū)域跨度18.9cM，由此得出了DUH的隱性遺傳機制，并證明DSH和DUH是兩種遺傳病。

作者單位：250012 濟南，山東大學醫(yī)學院（房小凱）；山東大學齊魯醫(yī)院皮膚科（孫青）

值得一提的是，關于家族性進行性色素沉著和色素減退癥（FPHH）的研究也涉及此染色體區(qū)域。FPHH被認為是低外顯率的常染色體顯性遺傳病。臨床表現為自出生后即有，隨年齡逐漸加重，表現為全身彌漫性分布的棕色或深棕色斑或色素減退斑，間有點狀或島嶼狀正常皮膚區(qū)，有牛奶咖啡斑。FPHH有別于家族性進行性色素沉著癥（FPH），FPH無色素減退特征，且在組織學表現上與DUH很接近。Amyere等［13］對7個FPHH家系進行全基因組連鎖分析，發(fā)現致病區(qū)域為12q21.12-q22，與DUH致病區(qū)域12q21-q23部分重疊。進一步發(fā)現此區(qū)域上KITLG基因在4個家系中存在3個不同突變，2個FPHH家系中出現的1個突變曾被報道過為FPH突變，而另2個p.Val33Ala和p.Thr34Pro未曾在FPH或其他疾病中發(fā)現，所有的3個突變均發(fā)生在KITLG基因的保守β鏈上。總之，單個基因的突變能導致不同的色素異常疾病，如FPH、FPHH以及類似DUH癥狀的疾病，因此，可以確定KITLG基因是皮膚色素調節(jié)的重要基因。

1.3 致病基因定位于2q35區(qū)域：2013年，Zhang等［5］首先將DUH的致病基因定位在2q35區(qū)域上的ABCB6基因。并對1個中國常染色體顯性遺傳DUH家系進行連鎖和單倍體分析，排除其致病基因在兩個已知區(qū)域6q24.2-q25.2和12q21-q23的可能性后，采用全基因組微衛(wèi)星標記掃描，經過連鎖和單倍體分析，發(fā)現其致病基因位于D2S325和D2S126之間，在D2S2382處得到最大LOD值3.49，將其定位在2q33.3-q36.1區(qū)域。同時，還對該家系中2例患者和1例健康人進行全基因組外顯子測序，經公共數據庫（dbSNP129、千人基因組計劃、HapMap和YH數據庫）排查，發(fā)現2例患者存在的29個相關變異中，只有2個突變，ABCB6上c.1067T＞C和ZNF142上c.2584C＞T在2q33.3-q36.1區(qū)域。為確定致病突變，利用ABI3730XL DNA分析儀進行了Sanger測序，經共分離分析發(fā)現，只有ABCB6基因上外顯子5的突變c.1067T＞C僅發(fā)生于患者，健康人則不發(fā)生。另一個突變，ZNF142上外顯子8的突變c.2584C＞T則被共分離分析所排除，并被證實與加州大學圣克魯茲分?；蚪M網站最新發(fā)布的SNP位點相同。結果說明，ABCB6是DUH的致病基因。

近期，Liu等［14］分別通過全基因組連鎖，外顯子測序和Sanger測序確認了這一結果。首先采用Illumina 660W-Quad BeadChip芯片，對1個中國常染色體顯性遺傳模式DUH家系中的12個個體進行全基因組關聯分析，在 2q34-2q37、10q25、13q12-13q14、17q25和20p12這5個染色體區(qū)域內得到最大LOD值為1.81，經單倍型分析，其連鎖區(qū)間在4 MB到24 MB之間。隨后對家系1的4例患者進行全基因組外顯子測序，當只考慮非同義和拼接位點單核苷酸變異時，4例患者中共有4 625個單核苷酸變異，其中98個不在千人基因組計劃或dbSNP數據庫中，只有chr2:220079139在4例患者中雜合，并且單倍型共分離分析定位于關鍵連鎖區(qū)域，這個編碼突變（c.1358C＞T;p.Ala453Val）位于ABCB6基因的外顯子7上，功能預測顯示其將被SIFT和PolyphenⅡ破壞。為了證實這個突變位點，對家系1中的13個體ABCB6基因的所有外顯子進行Sanger測序，在5例患者中，此突變是雜合的，而在8例健康個體和1 016例健康人中未發(fā)現ABCB6基因外顯子7突變。同時還對另外4個DUH家系和2例散發(fā)病例的ABCB6基因的所有外顯子和內含子進行了Sanger測序。在其中1個家系患者中，發(fā)現外顯子4上的編碼突變（chr2:220081092，c.964A＞C;p.Ser322Lys），在這個家系的健康人、其他3個家系和散發(fā)病例中，均未發(fā)現ABCB6突變，說明DUH存在遺傳異質性。

Cui等［15］同樣證實了該結果，在對 1個具有21例患者，14例健康人的DUH家系和3例散發(fā)的DUH病例，采用Affymetrix GeneChip進行全基因組關聯研究，通過連鎖分析在染色體2q35-q37.2區(qū)域發(fā)現最大LOD值4.68。同時，對家系中的3例患者和1例健康個體進行了外顯子測序，用外顯子數據庫進行序列數據分析過濾后，3例患者仍有39個SNP和17個缺失或插入共56個變異型，其中4個發(fā)生雜合突變的基因USP40、ABCB6、SLC11A1和NCL被選為候選基因，USP40、SLC11A1和NCL被Sanger測序排除，而ABCB6基因上c.1663 C＞A,p.Gln555Lys突變被證實。在1個散發(fā)病例中發(fā)現ABCB6基因上突變g.776 delC,c.459 delC，另外2個散發(fā)病例則未發(fā)現ABCB6基因突變。

2 致病基因的功能驗證

上述研究證實了DUH致病基因為ABCB6基因，其位于2q35上，共有19個外顯子，編碼的膜相關蛋白是ATP結合盒超家族（ABC）轉運蛋白基因的一種。ABC蛋白運輸不同的分子進出細胞膜，分為 7 個不同的亞家族：ABC1、MDR/TAP、MRP、ALD、OABP、GCN20、White 和 ABCB6 蛋白是 MDR/TAP亞家族的一種，包含842個氨基酸，有8個跨膜區(qū)域，存在于細胞質膜和細胞器中。Kiss等［16］用共聚焦顯微鏡、電子顯微鏡等多種顯像方式，確定ABCB6蛋白通過胞吞作用進入質膜并存在于溶酶體中。Chavan 等［17］發(fā)現，ABCB6 可通過在細胞質和線粒體間運輸糞卟啉原Ⅲ調節(jié)亞鐵血紅素的合成，并證明線粒體ABCB6蛋白和其運輸機制有直接關系。報道稱ABCB6的錯義突變還可導致假性高鉀血癥（p.R375Q）［18］和視力缺損（p.A57T和 L811V）［19］。

近期研究從基因不同功能層面上驗證了ABCB6在DUH中的作用。首先是mRNA表達，Liu等［14］在4例攜帶ABCB6突變的DUH患者和4例健康人的皮膚組織中，用實時定量反轉錄PCR的方法，研究了ABCB6 mRNA的表達，發(fā)現兩者間表達差異無統計學意義。

為分析ABCB6蛋白在細胞和組織中的定位，Liu等［14］對1例患者和健康人的石蠟包埋皮膚組織進行了免疫組化分析，在人表皮黑素細胞中，發(fā)現了ABCB6蛋白表達，在基底層角質形成細胞中無表達，未發(fā)現患者與健康人間有明顯表達差異，分析可能只是ABCB6的亞細胞定位不同而非表達水平有差異。Zhang等［5］對于ABCB6在人類上皮細胞中的表達進行了免疫組織化學分析和蛋白免疫印跡研究。為了檢測ABCB6在皮膚中的表達水平，對正常腹部皮膚進行免疫組織學染色，發(fā)現ABCB6的多克隆抗體在上皮細胞質中彌散性分布。蛋白免疫印跡研究顯示，ABCB6在HaCaT和A375細胞中表達，明確了ABCB6在黑素細胞和角質形成細胞中有表達。Cui等［15］同樣在前期確定致病基因ABCB6基礎上，對中國的1個DUH家系和3例散發(fā)病例ABCB6基因進行組織病理學、電鏡觀察和免疫組化分析，將具有c.1663 C＞A和c.459 delC突變的皮損組織和正常個體的皮膚組織用ABCB6的單克隆抗體免疫染色，發(fā)現黑素細胞對ABCB6表現出活躍的免疫反應性。

為進一步分析ABCB6在細胞中的定位。Zhang等［5］用免疫熒光染色檢查了野生型和小鼠B16細胞株中的突變ABCB6蛋白亞細胞定位，3種突變的ABCB6（p.Ser170Gly,p.Leu356Pro,和 p.Gly579Glu）用加強綠色熒光蛋白融合蛋白標記后，分別反轉錄入小鼠的B16細胞，經共聚焦顯微鏡觀察，野生型ABCB6定位在核內體部分，可以清楚地觀察到在樹突中聚集。而突變的ABCB6聚集在細胞核周圍區(qū)域的高爾基體內，不在樹突區(qū)。

動物實驗也驗證了ABCB6在發(fā)病中的作用，Liu 等［14］對斑馬魚的 ABCB6 基因同系物（zABCB6）中的外顯子6和8（等同于人類的ABCB6外顯子4和7）進行抑制分析。在活下來的胚胎中并未發(fā)現形態(tài)學異常，在發(fā)育中的胚胎里，黑素細胞發(fā)生變異變成斑塊狀的成熟黑素細胞，未經抑制的明顯比抑制的胚胎有更多成熟黑素細胞。為了確定ABCB6突變體中成熟黑素細胞減少的突變表現型是ABCB6表達抑制的特殊反應，將ABCB6突變體與標準長度的hABCB6 mRNA轉錄物共注射，發(fā)現對于部分ABCB6突變表現型，共注射是可以恢復表型的，接受共注射的胚胎明顯有更高的成熟黑素細胞水平，進一步證明了ABCB6在色素代謝方面的重要作用。

3 致病基因的突變檢測

據文獻檢索，目前已發(fā)現，ABCB6上DUH的突變位點共 8 個［5，14-15，20］，包括 7 個錯義突變，1 個移碼突變，均發(fā)生在進化保守的氨基酸上，全部來自于中國的家系和散發(fā)病例。除前面描述的突變位點外，近期Lu等［20］在4個DUH家系和 2例DUH散發(fā)病例中發(fā)現了2個突變位點，分別為外顯子6上c.1270T＞C（p.Y424H）、外顯子 4上 c.964A＞C（p.Ser322Lys）。其中 c.964A＞C與 Liu 等［14］發(fā)現的突變位點相同。

4 結語

目前研究已發(fā)現了DUH的3個致病區(qū)域，且在其中2q35區(qū)域中發(fā)現了致病基因ABCB6，并經功能學試驗證實，同時也發(fā)現該病有明顯的遺傳異質性。隨著分子生物學、分子遺傳學等學科的不斷發(fā)展，多種基因測序和功能研究的方法逐漸成熟，對于DUH遺傳學的研究也將更一步深入，而隨著更多致病基因和突變位點的發(fā)現，將了解DUH的更多遺傳特征，為臨床實現對于DUH的基因治療提供依據。

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Genetic advances in dyschromatosis universalis hereditaria

Fang Xiaokai*,Sun Qing.*Shandong University School of Medicine,Jinan 250012,China

Dyschromatosis universalis hereditaria （DUH） is inherited mainly in an autosomal dominant manner,sometimes in an autosomal recessive manner.In recent years,great progress has been made in molecular genetics of DUH.Three pathogenic genetic loci have been reported to be associated with DUH,including 6q24.2-q25.2,12q21-q23 and 2q35.The ATP-binding cassette,sub-family B,member 6 （ABCB6）gene at2q35 has been identified as a pathogenic gene forDUH by gene function analysis.Immunohistochemical studies showed that anti-ABCB6 antibodies were diffusely distributed in the cytoplasm of epithelial cells,Western blot analysis revealed that ABCB6 was expressed in melanocytes and keratinocytes,and zebrafish assays demonstrated that ABCB6 played an important role in pigment metabolism.By now,8 mutations of the ABCB6 gene have been reported in patients with DUH,including 1 frameshift mutation and 7 missense mutations.

Cytogenetics; Genes, ABCB6;Mutation;Genetic heterogeneity;Dyschromatosis universalis hereditaria

Sun Qing,Email:sunqing7226@163.com

2015-03-11）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.02.010

孫青，Email:sunqing7226@163.com

本文主要縮寫：DUH：遺傳性泛發(fā)性色素異常癥，ABCB6：ATP結合盒亞家族B成員6，DSH：遺傳性對稱性色素異常癥，SNP：單核苷酸多態(tài)性，FPH：家族性進行性色素沉著癥，ABC：ATP結合盒超家族，FPHH：家族性進行性色素沉著和色素減退癥