吳云鼎綜述 解保生審閱

(1.昆明醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院口腔科，云南 昆明 650000；2.昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，云南 昆明 650031)

消毒對病毒殺滅效果的實驗室評價

吳云鼎1綜述 解保生2審閱

(1.昆明醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院口腔科，云南 昆明 650000；2.昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，云南 昆明 650031)

病毒感染是人類所面臨的一項嚴峻挑戰(zhàn)，尤其是近些年來醫(yī)院內(nèi)感染控制形勢嚴峻和新型病毒感染疫情的爆發(fā)，使得有效控制病毒的傳播感染受到越來越多的關(guān)注。對于阻斷病毒的傳播感染，消毒劑的研究使用是一個重要的手段。消毒劑種類繁多，日新月異，隨之而來的問題就是如何有效客觀地評價各種消毒劑對病毒的消毒效果。在此，本文擬對實驗室評價消毒對病毒消毒效果的方法做一綜述。

病毒；消毒劑；效果；實驗室評價

病毒是一類個體微小、結(jié)構(gòu)簡單、以單核酸作為遺傳物質(zhì)的微生物，只能在活的細胞或組織中存活增殖。在病毒家族中，有的病毒對人類具有很高的威脅性，如乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)，人類獲得性免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus， HIV)以及能夠引起嚴重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syndromes，SARS)的冠狀病毒。新近出現(xiàn)的H7N9禽流感病毒也被證實對人類存在感染致病性[1]。其中對口腔診療威脅性較大的是HBV，截止到2013年，全世界約有20億HBV攜帶者[2]，加強口腔診療中HBV感染的控制顯得尤為重要。人類關(guān)于由病毒導致的疾病的最早記載可追溯到公元前3世紀，自19世紀末病毒的存在被證實發(fā)現(xiàn)以來，人類對于病毒危害的認識也在不斷的深化。加上近些年來由病毒感染引起的疫情爆發(fā)及防控形勢的日趨嚴峻，有關(guān)病毒的消毒問題受到了更多的關(guān)注。在病毒的消毒殺滅方面，消毒劑的使用是重要的一環(huán)。

消毒劑或其他消毒方法在正式投入實際使用之前，需要先進行消毒效果評價，目前在實驗室中常用的評價病毒消毒效果的方法主要有分子生物學評價法和細胞培養(yǎng)評價法。分子生物學的評價方法，如實時定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)[3]、酶連免疫反應(ELISA)[4]等；細胞培養(yǎng)方法是建立病毒易感細胞模型來將、檢測消毒效果[5]。在此基礎(chǔ)上又衍生出替代病毒評價法，該法是采用于所研究的病毒遺傳和性狀類似的病毒，通過評估消毒對該病毒的消毒效果來評估消毒劑的作用效果[6]。本文擬對消毒對病毒殺滅效果的實驗室評價的有關(guān)問題做一綜述。

1 常用消毒劑消毒效果評價方法(Frequently-used experimental assay approaches)

消毒對病毒殺滅效果的分子生物學評價法多為一些分子生物學的實驗方法，其特點是對構(gòu)成病毒的某一穩(wěn)定成分進行定量測定，如核酸、蛋白抗原或消毒反應形成的復合物等，根據(jù)相應指標反映消毒對病毒的滅殺效果。

1.1 實時定量PCR(Real-time PCR assay) 核酸是病毒的重要組成部分，乙型肝炎病毒的遺傳物質(zhì)為長約3 200 bp的DNA，分別編碼乙肝病毒的聚合酶、表面抗原和蛋白質(zhì)等[7]，乙肝DNA遺傳物質(zhì)在病毒的復制感染和性狀表現(xiàn)方面具有非常重要的作用。乙型肝炎病毒DNA的水平反映了乙肝病毒的復制數(shù)量及感染嚴重程度，與病情進展密切相關(guān)。臨床上，HBV DNA的數(shù)量水平是乙型肝炎臨床療效評價的一個重要指標[8-9]。在Real-time PCR問世后不久，就有學者將其運用于HBV DNA水平的檢測[10]，并隨著時間的推移，該技術(shù)也成為了臨床上診斷乙型肝炎和評估抗HBV治療效果的常規(guī)技術(shù)。Real-time PCR作為當前臨床上有效檢測HBV DNA的手段，在消毒劑對HBV消毒效果的評價中也發(fā)揮著積極的作用[3]。該方法的基本原理是使用熒光標記分子，對樣本擴增時每個循環(huán)熒光信號積累進行檢測，通過熒光信號的積累來計算出起始的樣本拷貝數(shù)。Real-time PCR可以粗分為染料法和探針法兩種。染料法成本相對較低，最常用的為SYBR I型染料，但是因為染料與反應體系中的雙鏈DNA(如引物二聚體)都能夠產(chǎn)生結(jié)合，從而發(fā)出熒光，在使用時需要通過溶解曲線來評價反應的特異性。探針法則成本較高，探針的設計基本針對的是目標中的保守序列，特異性強，目前臨床上使用的商品化HBV DNA檢測試劑盒多屬探針法。雖然Real-time PCR技術(shù)有著快捷高效、特異性強的優(yōu)點，但是它在某些條件下并不適用于病毒的檢測和消毒效果的評估。在病毒的檢測方面，病毒的分離始終是病毒檢測的金標準。Suarez等[11]在“實時定量PCR測定多種消毒劑對禽流感病毒消毒效果的研究”中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過酚類消毒劑消毒后，病毒分離結(jié)果提示樣本中已經(jīng)無H7N2病毒存在，但是經(jīng)Real-time PCR仍然可以在樣本中檢測到H7N2病毒核酸。出現(xiàn)這種狀況的原因可能是由于酚類消毒劑的消毒機制主要是通過破壞H7N2病毒的“外殼”，而并不破壞病毒的遺傳物質(zhì)，致使Real-time PCR產(chǎn)生與實際不相符合的結(jié)果，如果在此以Real-time PCR的結(jié)果作為消毒效果評價的依據(jù)，將會導致對消毒劑消毒效果的錯誤認識，認為消毒劑沒有充分殺滅病毒，進而降低了對消毒劑效果的評價的客觀性和準確性。這提示在選擇評價消毒對病毒的殺滅效果時，應該根據(jù)檢測的病毒組分和充分考慮消毒反應會產(chǎn)生的結(jié)果來選擇合適的消毒效果評價方法。除了Real-time PCR定量檢測病毒，根據(jù)研究需要，也可以使用PCR對病毒進行定性檢測。Bisset等[12]在“胃腸道內(nèi)窺鏡消毒失敗影響因素的前瞻性組群研究”中，使用PCR技術(shù)檢測經(jīng)過標準流程消毒后胃腸道內(nèi)窺鏡表面殘留的微生物情況，發(fā)現(xiàn)使用過的胃鏡消毒后仍存在污染的幾率與其使用的次數(shù)呈明顯的正相關(guān)，其中有1例丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)陽性患者使用的胃鏡消毒后，經(jīng)PCR可檢測到HCV存在，盡管消毒劑未能完全殺滅胃鏡上的HCV，但其殘留的量并不足以引發(fā)二次HCV感染，通過電話回訪使用過內(nèi)窺鏡的500例患者，無一例報告有相關(guān)并發(fā)癥產(chǎn)生。

1.2 酶聯(lián)免疫反應吸附劑測定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) Engvall等[4]于1971年發(fā)文報道了關(guān)于酶聯(lián)免疫反應吸附劑測定IgG抗體含量的研究后，ELISA被廣泛用于液體標本中微量物質(zhì)的測定，并得到不斷地發(fā)展完善，對病毒抗原抗體的測定也是ELISA的應用之一。ELISA技術(shù)的原理是通過反應生成酶－抗原/抗體有色復合物，顏色的深淺與有色復合物的量成正比關(guān)系，由于酶的活性非常高，所以ELISA技術(shù)的靈敏度也很高。1995年，Gasparini等[13]采用ELISA技術(shù)檢測消毒劑Virkon(商品名“衛(wèi)可”，美國杜邦公司產(chǎn)品)對器械表面HBV的消毒效果，結(jié)果顯示Virkon消毒10 min可有效清除HBV的表面抗原HbsAg；在“γ射線滅活HIV-I型病毒感染”研究中，Smith等[14]研究采用不同劑量的γ射線對HIV-I型病毒進行照射后，采用ELISA檢測HIV-I型病毒的核心抗原，測試照射對HIV-I型病毒的殺滅效果，結(jié)果顯示隨著照射劑量的上升，逆轉(zhuǎn)錄酶的活動減弱，2.5 Mrad劑量的γ射線照射能夠有效抑制HIV-I型病毒的增殖；Mikhail等[15]在“丙型肝炎患者使用腸道內(nèi)窺鏡造成交叉感染的前瞻性研究”中，通過ELISA檢測HCV攜帶者使用過的內(nèi)窺鏡消毒后HCV表面抗原的存在，以此判定是否可能造成HCV交叉感染，結(jié)果顯示149例HCV攜帶者使用過的腸道內(nèi)窺鏡經(jīng)消毒后再次使用并不會造成新的HCV感染。ELISA為病毒檢測提供了一種行之有效且可靠的檢測方法，拓寬了實驗室評價消毒劑消毒效果的途徑。在前述分子生物學方法中，一般需要直接獲取擬研究的相關(guān)病毒。但是由于一些作為研究對象的病毒無法直接在體外進行培養(yǎng)增殖，可能不便于直接獲取。學者們利用某些病毒之間在遺傳和性狀方面有著較高的相似性這一特點，運用與擬研究病毒的遺傳基因和性狀相似的病毒作為替代實驗對象，于是“替代病毒評價法”應運而生。該法通過評估消毒劑對“替代病毒”的消毒效果，進而推測該消毒劑對擬研究病毒的消毒效果。這些病毒之間不只是遺傳和性狀相似，在某些條件下對外部的刺激和反應也很相似，如鴨乙肝病毒(Duck Hepatitis B virus，DHBV)在造成和誘導長期感染方面和人HBV非常類似[6]。

眾所周知，HBV幾乎不能在體外進行培養(yǎng)增殖，也不會對常見的實驗動物造成感染[16]。DHBV與HBV同屬脫氧核苷酸病毒科，鴨乙肝病毒在性狀組成和致病性方面與HBV高度相似，且其自身對于消毒劑的敏感度與HBV近似，對人無明顯致病性[17]，因此被廣泛地用于替代HBV進行消毒效果評價。由于DHBV對鴨易感，可以在鴨上建立DHBV感染動物模型，DHBV動物模型的建立促進了對HBV消毒的研究[17-20]。除了HBV有與之相似的病毒可以作為替代病毒進行研究，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)和諾瓦克病毒(Norwalk virus，NV)也分別有可替代的病毒來代替它們進行消毒效果的評價研究。HCV自身屬于RNA病毒，由于缺乏適合HCV生存的細胞培養(yǎng)體系，加之該病毒只感染特定宿主，體外增殖培養(yǎng)困難，在HCV的消毒研究當中，采用的替代病毒為牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)。BVDV根據(jù)基因型的不同可分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種類型，然而兩種基因型的BVDV都與HCV在基因結(jié)構(gòu)上具有相似性[21]，且BVDV與HCV在增殖方式上也有相似之處[6]。NV病毒易引起胃腸道感染，NV與貓杯狀病毒(Feline calivirus，F(xiàn)CV)兩者在基因組成和生化性質(zhì)上非常類似[22]，且FCV容易在體外培養(yǎng)的細胞中生長存活，方便取材和培養(yǎng)。除了FCV，兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)也與NV非常類似，可作為NV的替代病毒用于研究。所以研究無法在體外進行培養(yǎng)病毒的消毒效果時，往往使用前述的替代病毒進行。一些國家和地區(qū)也接受和采取替代病毒測試的結(jié)果作為新型消毒劑消毒效果評價的標準，如美國FDA承認消毒劑對DHBV消毒效果作為HBV消毒效果測試的參考標準[23]。

1.3 細胞培養(yǎng)評價法(Cell culture assay) 細胞培養(yǎng)評價法是通過病毒感染體外培養(yǎng)的細胞，繼而從感染細胞中獲取病毒，置于消毒劑中進行消毒效果測定，是一種傳統(tǒng)的評價消毒劑對病毒消毒效果的方法。早在1985年，Keswick等[5]就采用恒河猴腎細胞來評價氯消毒劑對諾瓦克病毒在飲用水中的消毒效果，在接下來的數(shù)年當中，應用細胞培養(yǎng)的方法來評估消毒劑對病毒消毒效果的研究也日漸增多[24-25]。但是細胞培養(yǎng)方法耗時長，靈敏度不如PCR，也有不同意見認為細胞培養(yǎng)方法不適合用于病毒的消毒效果研究[25]。

2 病毒消毒效果評價方法的選擇

如前所述，目前有多種病毒消毒效果的評價方法可供選擇。在實際情況下，應該根據(jù)實際需要來選擇合適的病毒消毒效果評價方法，以達到客觀評價消毒對病毒殺滅效果的目的。要達到這個目的，需要注意以下兩點：首先應該明晰消毒劑的作用機理，才能有針對性地選擇消毒效果的檢測指標，因為不同的檢測方法針對的對象不同，如PCR方法檢測的對象是病毒的核酸(RNA或者DNA)，而ELISA則是檢測病毒蛋白抗原的有效方法。如果對消毒劑的消毒機理和反應情況了解不足，就可能會出現(xiàn)與前述的禽流感病毒消毒效果研究類似的情況—病毒表面抗原已經(jīng)滅活而Real-time PCR仍然可以檢測出病毒核酸的存在，事實上該研究使用的6種消毒劑當中，只有含氯消毒劑和過氧化物消毒劑對禽流感病毒的核酸造成了破壞[11]。其次，要了解采用的技術(shù)的優(yōu)點和缺點，揚長避短，根據(jù)實際情況來調(diào)整實驗策略。同樣采用Real-time PCR對HBV的消毒效果進行檢測，擴增的HBV序列范圍不同(部分基因189 bp和全基因組3 200 bp擴增)，其檢測結(jié)果也大不相同，全基因組擴增顯示RD88消毒劑(1.3%過氧乙酸和7.5%過氧化氫)消毒60 min可以殺滅97%的HBV，而部分基因擴增顯示RD88消毒劑60 min只能殺滅75.4%的HBV[26]，分析導致這種差異可能的原因之一是消毒劑雖然破壞了HBV的基因結(jié)構(gòu)，但是被破壞的基因結(jié)構(gòu)中可能恰好包含了所選取的189 bp的序列在內(nèi)，與未被破壞的基因同時得到了擴增，故而有此差異存在。建議在選用Real-time PCR評估消毒劑對HBV的消毒效果時，采用全基因組擴增更為可靠。

因此在評價消毒劑消毒效果的實驗中，采用的檢測方法應該根據(jù)實際的需要，結(jié)合現(xiàn)有條件來綜合考慮，選取適宜的檢測方法，以達到客觀準確評價消毒劑消毒效果的目的。

3 總 結(jié)

消毒一直是感染控制中的重要環(huán)節(jié)，是阻斷病原體傳播致病的有效手段，也是許多學者致力研究的課題之一。高效安全的消毒劑可以幫助減少感染的傳播和降低院內(nèi)感染的概率，提高醫(yī)療環(huán)境的安全性?，F(xiàn)目前各種消毒劑種類繁多，效用不一，因此合理地選擇合適的實驗方法，客觀地評價消毒劑的消毒效果，有助于消毒劑的使用和改進，同時指導人們正確選擇合適的消毒方式，以達到較好的病毒殺滅效果，從而控制病毒的感染和傳播，減少病毒的致病可能，創(chuàng)造更加安全的醫(yī)療衛(wèi)生和生活環(huán)境。

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Experimental evaluation on the germicidal efficacy of disinfectant.

WU Yun-ding1,XIE Bao-sheng2.1.Department of Stomtology,the Affliated Children's Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650000,Yunnan,CHINA;2.The Affliated Hospital of Stomatology of Kunming Medical University,KunMing 650031,Yunnan,CHINA

Virus infection is a severe challenge for human.In recent years,increasing nosocomial infection and ourbreak of new virus have forced us to pay more and more attention to the effective control of virus infection and transmission.The research and use of disinfectant occupies an important position in cutting off virus infection and transmission.And the trouble with disinfectant growth is how to grant an objective and effective evaluation to disinfectant efficacy.Here,an overview on the methods of experimental evaluation on disinfectant efficacy will be presented.

Virus;Disinfectant;Efficacy;Experimental evaluation

R613

A

1003—6350（2016）04—0613—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.04.033

2015-07-10)

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學應用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項項目(編號：U0120140798)

解保生。E-mail：wrd5501@163.com