李婷

（貴州省龍里林場(chǎng) 貴州龍里 551200）

植物組織培養(yǎng)的污染防治

李婷

（貴州省龍里林場(chǎng) 貴州龍里 551200）

在進(jìn)行相關(guān)的研究中經(jīng)常會(huì)需要對(duì)于特定的植物進(jìn)行培養(yǎng)，以便于獲得所需要的信息。但是在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)發(fā)生培養(yǎng)組織發(fā)生污染的現(xiàn)象，導(dǎo)致植物組織的培養(yǎng)失敗，無(wú)法打到培養(yǎng)的目的。本文首先介紹了植物組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生污染的主要原因以及不同污染的不同特性，然后在此基礎(chǔ)上分別介紹了不同污染下應(yīng)當(dāng)采取的應(yīng)對(duì)措施，然后闡述了對(duì)于植物組織培養(yǎng)中污染苗的搶救方法，以期提高植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)效率。

植物；組織培養(yǎng)；污染防治

1 植物組織培養(yǎng)污染的原因及其特性

1.1 內(nèi)因污染

內(nèi)因污染簡(jiǎn)單的說(shuō)就是污染的來(lái)源是在于培養(yǎng)的內(nèi)部，也就是說(shuō)導(dǎo)致污染的污染源在于培養(yǎng)皿內(nèi)部，也就是來(lái)源于培養(yǎng)的植物本身。很多的植物自身的表皮以及內(nèi)部均含有大量的病菌，這些病菌在植物正常生長(zhǎng)過(guò)程中不會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)造成影響，但是在進(jìn)行植物的組織培養(yǎng)時(shí)這些病菌就會(huì)進(jìn)入培養(yǎng)皿中，從而對(duì)于植物組織的培養(yǎng)造成影響。這些病菌的種類(lèi)很多，包括了芽孢桿菌屬、、歐文氏菌屬、土壤桿菌屬、黃單胞菌屬、棒狀桿菌屬霉菌屬以及假單胞菌屬等。

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的初代培養(yǎng)過(guò)程中，有時(shí)候由于植物表面存在一定的細(xì)菌，因此培養(yǎng)時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)在植物組織的周邊會(huì)能夠觀察到不同顏色的菌落以及油污或者水污等。在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，如果發(fā)現(xiàn)植物的表面在培養(yǎng)初期不存在菌落，但是培養(yǎng)4d左右以后開(kāi)始不斷的出現(xiàn)軍力，這就說(shuō)明時(shí)由植物內(nèi)生的細(xì)菌引起的污染。

1.2 外因污染

外因污染指的是由與外在的因素導(dǎo)致的植物組織培養(yǎng)污染，在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，如果培養(yǎng)皿或者接種的工具設(shè)備等在進(jìn)行消毒時(shí)沒(méi)有能夠確保消毒干凈，就會(huì)在設(shè)備上殘留一定的細(xì)菌，在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)這些細(xì)菌就會(huì)導(dǎo)致植物組織的污染。這一類(lèi)的外因污染菌種主要以酵母菌、霉菌以及細(xì)菌為主。

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的組織附近出現(xiàn)泡沫或者時(shí)粘液，這種情況一般是由于細(xì)菌的污染所導(dǎo)致的，說(shuō)明在進(jìn)行培養(yǎng)的無(wú)菌操作時(shí)操作人員存在不規(guī)范的操作，導(dǎo)致了細(xì)菌的污染。而在培養(yǎng)過(guò)程中如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中出現(xiàn)不同顏色的霉菌，一般是因?yàn)榻臃N時(shí)室內(nèi)的空氣被污染而導(dǎo)致的。

2 植物組織培養(yǎng)污染的防治措施

在分析植物組織培養(yǎng)污染的原因時(shí)發(fā)現(xiàn)植物組織培養(yǎng)過(guò)程中污染的主要原因有兩個(gè)：①內(nèi)部原因；②外部原因。在植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，要想有效的控制污染的發(fā)生應(yīng)當(dāng)從這兩個(gè)原因分別入手，有針對(duì)性的采取措施來(lái)提高培養(yǎng)的成功率。具體的植物組織培養(yǎng)污染防治措施如下：

2.1 內(nèi)因污染的防治措施

2.1.1 在合適的時(shí)間段選取植物

在進(jìn)行植物組織的培養(yǎng)之前首先要做的便是選擇合適的植物來(lái)進(jìn)行取樣，在選擇植物的時(shí)候應(yīng)當(dāng)選擇植物成熟、等待采摘的時(shí)節(jié)下的植物，選取的植物部位應(yīng)當(dāng)盡量選取采摘的部位。之所以這樣選擇是因?yàn)槌墒斓闹参矬w內(nèi)含有較強(qiáng)的活力，在培養(yǎng)時(shí)利于培養(yǎng)，并且由于植物較為活躍，其內(nèi)部的抗菌能力也會(huì)相對(duì)較強(qiáng)。再加上在這個(gè)時(shí)間段細(xì)菌還沒(méi)有活躍，因此在培養(yǎng)時(shí)能夠增加培養(yǎng)的成功率。在選擇植物的種類(lèi)時(shí)應(yīng)當(dāng)選擇無(wú)毒的植株，如果不存在無(wú)毒植株則應(yīng)當(dāng)進(jìn)行處理，通過(guò)技術(shù)手段培育出無(wú)毒植株然后再選擇使用。

2.1.2 做好植物的殺菌處理工作

在選擇好植物以后，應(yīng)當(dāng)對(duì)于選擇的植物進(jìn)行殺菌消毒處理，最大程度上消除植物外表的細(xì)菌與病毒，從而提高培養(yǎng)的成活率。在進(jìn)行滅菌時(shí)一般會(huì)進(jìn)行表面滅菌與深滅菌兩個(gè)步驟的處理。表面滅菌是將采摘的植物體在洗凈以后進(jìn)行表面的殺菌處理，并將其裁剪成為適宜的大小。等到裁剪完成以后就進(jìn)行深滅菌處理，表面滅菌盡管能夠去除植株表面的細(xì)菌，但是植物內(nèi)部的細(xì)菌卻無(wú)法祛除，這種情況下就需要進(jìn)行深滅菌處理。深滅菌處理是以消毒液、真空減壓、水浴、抗生素、磁力攪拌、灼燒以及超聲波振動(dòng)等方式來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)于細(xì)菌的深層滅殺。

2.2 外因污染的防治措施

2.2.1 確保接種環(huán)境的無(wú)菌

在進(jìn)行植物組織的培養(yǎng)接種之前應(yīng)當(dāng)先進(jìn)行操作環(huán)境的殺菌處理，確保操作環(huán)境的無(wú)菌。在進(jìn)行操作環(huán)境的處理時(shí)首先是以酒精來(lái)對(duì)于室內(nèi)的地面環(huán)境以及操作臺(tái)進(jìn)行殺菌處理，然后以紫外線對(duì)于空氣中的細(xì)菌進(jìn)行滅殺。對(duì)于操作室應(yīng)當(dāng)定期進(jìn)行殺菌處理，并控制室內(nèi)的濕度確保濕度在70%左右。

2.2.2 操作人員應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格安裝無(wú)菌操作流程操作

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的接種過(guò)程中，操作人員的操作將會(huì)直接影響到最終的培養(yǎng)結(jié)果。對(duì)于操作人員應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格的安裝無(wú)菌的操作規(guī)范進(jìn)行操作，操作人員在操作之前應(yīng)當(dāng)穿好工作服以及工作帽、手套、口罩以及鞋套等設(shè)備，并做好全身的消毒，確保在進(jìn)行操作時(shí)是處于一個(gè)無(wú)菌的環(huán)境之中的。在進(jìn)行接種操作的過(guò)程中應(yīng)當(dāng)盡量避免打開(kāi)操作間的門(mén)窗，如果接種的周期較長(zhǎng)，不得不離開(kāi)操作間則應(yīng)當(dāng)定期進(jìn)行操作間的殺菌消毒處理，并且操作人員在每次出入操作間之前均應(yīng)當(dāng)做好相應(yīng)的殺菌消毒。

2.2.3 確保培養(yǎng)器材以及材料的質(zhì)量

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中一定要確保植物組織培養(yǎng)的質(zhì)量，在接種的過(guò)程中確保選中的接種植株的質(zhì)量，如果發(fā)現(xiàn)植株存在污染的情況則應(yīng)當(dāng)在第一時(shí)間將其處理掉。避免由于植株的污染導(dǎo)致接種后影響成功率。此外由于很多的設(shè)備在長(zhǎng)期的放置以后會(huì)發(fā)生松動(dòng)，從而導(dǎo)致一些原本密閉的設(shè)備內(nèi)部發(fā)生老化，從而影響設(shè)備內(nèi)部的潔凈度。對(duì)于這樣的設(shè)備應(yīng)當(dāng)做好前期的檢查工作，避免由于設(shè)備的污染導(dǎo)致接種組織的污染。

2.2.4 合理添加抗生素

在操作過(guò)程中，如果嚴(yán)格的安裝上述的方法進(jìn)行操作，從理論上而言應(yīng)該不會(huì)發(fā)生外因污染了，但是在實(shí)際的培育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)由于培養(yǎng)架上的細(xì)菌以及螨蟲(chóng)的滋生會(huì)對(duì)于培養(yǎng)基造成一定的污染，因此在實(shí)際的操作中還會(huì)選擇在培養(yǎng)基中添加一定的抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)于細(xì)菌的抑制，避免其污染培養(yǎng)基。

抗生素在培養(yǎng)中的應(yīng)用在很久以前就被應(yīng)用與動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)中，而在植物組織的培養(yǎng)過(guò)程中還尚處于一個(gè)初期階段，在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中添加抗生素作為一項(xiàng)可行的措施但是還需要進(jìn)行一定的探究。盡管使用抗生素能夠有效的滅殺細(xì)菌，確保培養(yǎng)的效率，但是卻無(wú)法確保抗生素會(huì)不會(huì)對(duì)于植物組織的生長(zhǎng)與發(fā)育產(chǎn)生影響，并且在培養(yǎng)過(guò)程中抗生素的濃度以及種類(lèi)均需要進(jìn)行相應(yīng)的研究。

3 植物組織培養(yǎng)中污染苗的搶救

細(xì)菌被污染后，由于細(xì)菌繁殖靠芽孢，細(xì)菌不會(huì)彌散整個(gè)空間，因此只要及時(shí)發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感菌部分去除轉(zhuǎn)接，材料仍然可以用；但若真菌被污染，則必須經(jīng)高溫、高壓滅菌后扔掉，即使僅形成菌絲，因?yàn)榫z能到達(dá)材料內(nèi)部，真菌污染是滅絕性的。

用抗生素等殺菌劑處理，雖有不少報(bào)道，但至今未發(fā)現(xiàn)有抗生素能對(duì)各種菌都有效，并且常會(huì)影響植物材料的正常生長(zhǎng)分化。有的另一些藥劑雖殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，無(wú)法利用。對(duì)已污染的培養(yǎng)物，有時(shí)因植物材料難得或重新發(fā)生要花費(fèi)很多時(shí)間，也可切取較大植株重新消毒接種。分別用400萬(wàn)、600萬(wàn)單位/L青霉素?zé)o菌水溶液浸泡銀白楊組織培養(yǎng)細(xì)菌污染苗40min以上，可有效防治組織培養(yǎng)中的細(xì)菌污染。處理過(guò)的苗繼代培養(yǎng)時(shí)，不再重復(fù)出現(xiàn)細(xì)菌污染現(xiàn)象，且苗分化能力強(qiáng)，生根培養(yǎng)時(shí)根系發(fā)達(dá)，移栽成活率高。研究證明，如果繼代培養(yǎng)中只有真菌污染，采用3%多菌靈無(wú)菌液浸泡0.5h以上即可，用無(wú)菌水沖洗后接種或不用無(wú)菌水沖洗直接接種都可消除真菌污染。如果在細(xì)菌污染和細(xì)菌、真菌同時(shí)污染的情況下，可采用HgCl2消毒法把污染培養(yǎng)苗切割成較長(zhǎng)莖段作外植體，用自來(lái)水沖洗0.5h，再在超凈工作臺(tái)上用乙醇和HgCl2進(jìn)行短時(shí)間處理，即可再度建立無(wú)菌苗培養(yǎng)體系。

4 結(jié)語(yǔ)

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，由于植物自身的因素以及外部操作的因素很容易導(dǎo)致培養(yǎng)的污染，因此在操作過(guò)程中一定要重視對(duì)于植物組織的培養(yǎng)過(guò)程，同時(shí)做好內(nèi)因污染與外因污染的控制，具有針對(duì)性的用合理的措施來(lái)處理不同的問(wèn)題，從而確保培養(yǎng)的成功率。

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S767.1

A

1005-7897（2016）12-0093-02

2016-6-10

李 婷（1986-），女，苗族，貴州龍里人，助理工程師，本科，主要從事工作和研究方向?yàn)橹参锝M織培養(yǎng)及森林病蟲(chóng)害防治方面。