韓貴良 石巖 任冠穎 王小磊

（河北大學附屬醫(yī)院腫瘤內科，河北保定071000）

鹽酸?？颂婺釋θ薚淋巴細胞增殖的影響

韓貴良 石巖 任冠穎 王小磊

（河北大學附屬醫(yī)院腫瘤內科，河北保定071000）

目的觀察酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine kinase inhibitor，TKI）鹽酸?？颂婺釋θ薚淋巴細胞增殖的影響。方法應用免疫磁珠分選的方法從外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中分選出T淋巴細胞，分別加入不同濃度的鹽酸?？颂婺崤囵B(yǎng)1 h后，加入PMA刺激T細胞增殖，培養(yǎng)48～72 h后分別收集細胞和細胞培養(yǎng)上清。采用四氮甲唑蘭比色法（MTT法）檢測各組細胞的增殖情況。結果本研究比較了培養(yǎng)72 h后各組細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)鹽酸?？颂婺崮軌蛞种芓細胞的增殖，各組抑制率如下：鹽酸?？颂婺?000 ng/mL組為（12.0±5.0）%（P=0.053），2500 ng/mL組為20.0±3.6%（P=0.011），5000 ng/mL組為21.6±5.6%（P=0.022）。結論鹽酸?？颂婺崮軌蛞种芓細胞的增殖。

酪氨酸激酶抑制劑；腫瘤免疫；T淋巴細胞

鹽酸?？颂婺崾俏覈哂型耆灾髦R產權的小分子靶向抗癌創(chuàng)新藥，臨床研究表明鹽酸?？颂婺嵩谕砥诜切〖毎伟┲委熯^程中顯示一定優(yōu)越性[1]。有研究報道酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼[2]、達沙替尼[3]、厄洛替尼[4]能夠抑制T細胞的增殖，但鹽酸埃克替尼對T淋巴細胞的增殖有何影響，尚未見報道，故作者進行了相關研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料：①細胞：人外周血T淋巴細胞為從人外周富集血中分離；②細胞培養(yǎng)試劑：細胞培養(yǎng)液RPMI1640（美國Invitrogen公司），胎牛血清（美國Gibco公司），96孔培養(yǎng)板（美國Corning公司），F(xiàn)icoll分離液（中國醫(yī)學科學院血液學研究所），Pan T cell isolation kitⅡ（德國Miltenyi Biotec公司）。

1.2 設備：超凈工作臺（上海力申科學儀器有限公司），HEPA CLASS100加濕CO2孵箱（美國Thermo公司），JX70倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司），Synergy HT酶標儀（美國BioTek公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 T細胞的分離：取4 mL富集外周血，F(xiàn)icoll分離法提取單個核細胞，應用Pan T cell isolation kitⅡ分選單個核細胞，分選柱下方所收集細胞即為T細胞。

1.3.2 T淋巴細胞的培養(yǎng)：所得T細胞以細胞培養(yǎng)液重懸，使細胞濃度為1.5×106/mL，以200 μL每孔接種到96孔板中。設對照組、鹽酸埃克替尼組，對照組鹽酸?？颂婺釢舛葹? ng/mL，鹽酸?？颂婺峤M設三個濃度：1000 ng/mL、2500 ng/mL、5000 ng/ mL；各組加入藥物后于37℃加濕5%CO2孵箱中培養(yǎng)1 h，然后各組均加入佛波酯（PMA），終濃度分別為50 ng/mL，培養(yǎng)48～72h。

1.3.3 MTT法檢測T細胞增殖情況：T淋巴細胞密度為1.5×106/mL，接種于96孔板中，每孔培養(yǎng)液200 μL，空白對照孔只加培養(yǎng)液。各組按1.3.2描述中加入藥物，37℃，5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱孵育72 h，每組每濃度設3個復孔。每孔加入5 mg/ mL MTT液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，離心培養(yǎng)板，吸棄上清，每孔加入DMSO150 μL，微量震蕩器震蕩10 min，490 nm波長下檢測每孔的吸光度（OD）值。按下列公式計算抑制率：抑制率=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，兩組定量資料的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

鹽酸?？颂婺崮軌蛞种芓淋巴細胞的增殖。我們比較了實驗組與對照組間的抑制率，鹽酸?？颂婺峤M1000ng/m組為12.0±5.0%（P=0.053），2500ng/ mLl組為20.0±3.6%（P=0.011），5000ng/mL組為21.6±5.6%（P=0.022）。隨藥物濃度增加，抑制率有提高趨勢，提示鹽酸?？颂婺釋細胞增殖的抑制呈濃度依賴性。

3 討論

鹽酸?？颂婺崾俏覈灾餮兄频?、具有世界專利的治療非小細胞肺癌的國家一類新藥，在分子水平，鹽酸?？颂婺嵋种艵GFR激酶活性的IC50（當50%酶活性被抑制時的抑制劑濃度）為5 nM，和國外上市產品相當。在測定了鹽酸?？颂婺釋?5種激酶（包括其突變型）的抑制活性的結果顯示，鹽酸?？颂婺嵩?.5 μM（100倍于對EGFR激酶活性抑制的IC50）時對EGFR激酶的抑制特異性較高，沒有顯示出對其它激酶的抑制，表明鹽酸埃克替尼是一個特異性較高的EGFR激酶抑制劑[5]。目前該藥物已廣泛應用于臨床，并改善了腫瘤患者的生存，但該藥物需長期應用，在用藥過程中是否會影響T細胞的增殖，目前尚未見報道，我們對此進行了研究。為了更加貼近臨床實際，我們選取人外周血中的T細胞作為研究對象，觀察了鹽酸埃克替尼對人T淋巴細胞增殖的影響。在實驗設計過程中，我們盡量使實驗條件與體內環(huán)境相似，藥物濃度的選取以腫瘤患者服藥后達到的穩(wěn)態(tài)血藥濃度為參考，實驗藥物濃度均在其附近。按臨床常規(guī)劑量（125 mg tid）應用鹽酸?？颂婺幔€(wěn)態(tài)血藥濃度為2500±378 ng/mL[6]，實驗組藥物濃度設為1000 ng/mL、2500 ng/mL、5000 ng/mL。MTT實驗發(fā)現(xiàn)，鹽酸?？颂婺崮軌蛞种芓細胞的增殖，僅在較高濃度時具有統(tǒng)計學差異。鹽酸?？颂婺崾峭ㄟ^何種機制抑制T淋巴細胞的增殖，目前已有酪氨酸激酶抑制劑影響細胞周期分布的報道，Ling等[7]已證實厄洛替尼通過誘導p27kip1的產生阻止細胞由G1期進入S期，從而實現(xiàn)G1期阻止，Qiong等[4]也發(fā)現(xiàn)厄洛替尼能夠使活化T細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase，CDK）抑制劑p27kip1的表達升高。舒尼替尼對細胞周期的影響亦有報道，Yanhong等[8]發(fā)現(xiàn)舒尼替尼能夠使T細胞內細胞周期素D3和磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）減少，同時CDK6、CDK4磷酸化水平降低，從而實現(xiàn)G1期阻滯。楊彩玲等[9]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸?？颂婺嵬ㄟ^降低人舌鱗狀細胞癌Tca8113，改變Tca8113的細胞周期分布，有明顯的G0/G1期阻滯作用，由此推斷鹽酸?？颂婺峥赡苁峭ㄟ^影響T細胞的周期分布，從而影響T淋巴細胞的增殖。

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［9］楊彩玲，韓新光，于春亞.鹽酸埃克替尼對人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞周期及Cy-clinD1、P27表達的影響［J］.鄭州大學學報（醫(yī)學版），2011，25（1）：82-85.

The Effect of Icotinib on the Proliferation of T Lymphocyte

Han Guiliang Shi Yan Ren Guanying Wang Xiaolei

（Department of Oncology；Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China）

ObjectiveTo observe the effect of tyrosine kinase inhibitor（TKI）such as icotinib on T lymphocyte.MethodsTlymphocytes were selected from peripheral blood mononuclear cells by immunomagnetic cell sorting.Then the T lymphocytes were stimulated by Phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）and increasing dose of icotinib was added to the experimental group.After culturing 48-72 hours the proliferation rate of the T lymphocytes was analyzed by MTT.ResultsWe compared the inhibitory rate between the control group and experiment group，and we found that icotinib can inhibit the proliferation of T lymphocyte.ConclusionIcotinib can inhibit the proliferation of T lymphocyte.

Targeted therapy；Tyrosine kinase inhibitor；Tumor immunology

R453

A 學科分類代碼：32067

1001-8131（2016）06-0639-02

2016-07-18