栗軍香，呼金田，耿靜，劉艷竹，張素軍，楊俊捧，王曉華

(1.河北工程大學附屬醫(yī)院檢驗科，河北 邯鄲 056002；2.河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚科，河北 邯鄲 056002；3.涉縣中醫(yī)院檢驗科，河北 邯鄲 056400；4.涉縣中醫(yī)中醫(yī)院兒科，河北 邯鄲 056400；5.邯鄲市邯山區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所監(jiān)督一科，河北 邯鄲 056001；6.河北工程大學醫(yī)學院生物教研室，河北 邯鄲 056002)

HIF-1α、VEGF在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其與腫瘤血管生成的關(guān)系

栗軍香1，呼金田1，耿靜2，劉艷竹3，張素軍4，楊俊捧5，王曉華6

(1.河北工程大學附屬醫(yī)院檢驗科，河北 邯鄲 056002；2.河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚科，河北 邯鄲 056002；3.涉縣中醫(yī)院檢驗科，河北 邯鄲 056400；4.涉縣中醫(yī)中醫(yī)院兒科，河北 邯鄲 056400；5.邯鄲市邯山區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所監(jiān)督一科，河北 邯鄲 056001；6.河北工程大學醫(yī)學院生物教研室，河北 邯鄲 056002)

目的 研究子宮內(nèi)膜癌組織中乏氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達情況及其與腫瘤血管生成的關(guān)系。方法選取2012年2月至2015年12月河北工程大學附屬醫(yī)院收治的48例子宮內(nèi)膜癌患者(內(nèi)膜癌組)，應(yīng)用免疫組織化學法分別檢測48例子宮內(nèi)膜癌組織及15例正常子宮內(nèi)膜(正常內(nèi)膜組)組織中HIF-1α和EGF的表達情況，并用CD34抗體標記血管內(nèi)皮細胞，測定微血管密度(MVD)值。對子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α、VEGF表達與臨床參數(shù)及MVD進行相關(guān)性分析。結(jié)果內(nèi)膜癌組患者組織中HIF-1α和VEGF高表達率分別為54.17%、75.00%，均明顯高于正常內(nèi)膜組的6.67%、13.33%，組間比較差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；內(nèi)膜癌組與正常內(nèi)膜組組織的MVD計數(shù)分別為(35.51±21.36)條、(3.66±4.52)條，組間比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；內(nèi)膜癌組織中HIF-1α和VEGF表達與患者的年齡、臨床分期、肌層浸潤程度無關(guān)(P＞0.05)，與組織分化程度相關(guān)(P＜0.05)，而MVD與患者年齡、組織分化程度、臨床分期、肌層浸潤程度均有相關(guān)性(P＜0.05)。HIF-1α與VEGF的表達呈正相關(guān)(r=0.485，P=0.021)；HIF-1α與MVD呈正相關(guān)(r=0.680，P=0.045)；VEGF和MVD亦呈正相關(guān)(r= 0.423，P=0.035)。結(jié)論子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α和VEGF均有高水平表達，并與腫瘤血管生成密切相關(guān)，兩者可作為子宮內(nèi)膜癌的腫瘤標志物，為臨床抗腫瘤治療提供新的方向。

子宮內(nèi)膜癌；乏氧誘導(dǎo)因子-1α；血管內(nèi)皮生長因子；免疫組織化學；微血管密度

子宮內(nèi)膜癌又稱子宮體癌，為子宮內(nèi)膜腺體的惡性腫瘤，約占女性癌癥總數(shù)的7%。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與長期使用雌激素藥物、高血壓、肥胖、糖尿病、不孕不育及絕經(jīng)等體質(zhì)因素及遺傳因素有關(guān)。近年來新發(fā)現(xiàn)的乏氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是缺氧狀況下廣泛存在于人體與哺乳動物中的一種核轉(zhuǎn)錄因子，其對腫瘤細胞的增殖、能量代謝以及腫瘤血管生成起著至關(guān)重要的作用[1]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是新生血管生成的重要因子，可促進腫瘤血管生成、浸潤和轉(zhuǎn)移[2]。HIF-1α與VEGF在肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中有較多研究，但在子宮內(nèi)膜癌中的報道卻比較少。本研究探討子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α、VEGF的表達及其與腫瘤血管生成的關(guān)系，以為抗腫瘤治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年2月至2015年12月我院婦產(chǎn)科存檔的子宮內(nèi)膜癌患者組織蠟塊48例(內(nèi)膜癌組)，對患者臨床資料進行回顧性分析。納入標準：所有患者術(shù)前2周均未接受化、放療或癌癥相關(guān)治療；無糖尿病、心臟病史且近期無外傷或其他手術(shù)史；排除合并心、肝、腎等重要臟器嚴重疾病者。48例患者年齡42～68歲，平均(43.5±4.22)歲；病理檢查均證實為子宮內(nèi)膜樣腺癌；根據(jù)FIGO分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期及以上14例；病理分級：高分化G113例，中等分化G220例，低分化G315例；肌層浸潤：≥1/2肌層20例，＜1/ 2肌層28例。取同期手術(shù)切除或門診刮取的正常子宮內(nèi)膜組織15例，為正常內(nèi)膜組。

1.2 檢測方法 采用免疫組織化學染色方法(IHC)檢測子宮內(nèi)膜癌患者組織中HIF-1α和VEGF的表達，用CD34抗體標記血管內(nèi)皮細胞。將患者術(shù)中切除的病理組織標本經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后，進行石蠟包埋，然后制作石蠟切片，切片厚約4 μm，采用經(jīng)多聚賴氨酸包被的載玻片進行貼片，于60℃電熱保溫干燥箱內(nèi)干燥24 h。將切片浸于二甲苯中脫蠟，然后經(jīng)梯度酒精水化，3%H2O2封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌；滴加一抗:同一病例用1:100稀釋兔抗人HIF-1α多克隆抗體工作液、原倍鼠抗人VEGF單克隆抗體工作液及原倍鼠抗人CD34單克隆抗體工作液分別孵育，置于4℃冰箱過夜；次日棄去一抗，PBS洗滌，滴加生物素標記的二抗，置于37℃恒溫箱孵育20 min；PBS洗滌后，加DAB工作液避光顯色3～5 min，蘇木素復(fù)染5 min，脫水至透明，中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判定 HIF-1α、VEGF的陽性表達為著色部位出現(xiàn)棕黃色顆粒，HIF-1α染色主要位于胞質(zhì)或胞核，VEGF主要位于胞漿。在顯微鏡下隨機選取5個視野(×400)，計數(shù)陽性細胞數(shù)量。評分：①按癌細胞著色深淺即染色強度評分：不著色：0分，黃色：1分，棕黃：2分，黃褐色：3分；②按陽性細胞率評分：即著色癌細胞數(shù)占癌細胞總數(shù)為該切片的陽性細胞百分率，＜5%：0分，5%～25%：1分，26%～50%：2分，51%～75%：3分，＞75%：4分。結(jié)果判定綜合免疫組化染色強度和陽性細胞數(shù)量：①、②兩項得分乘積為最終結(jié)果，將其分為四檔：0～1分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。將-、+歸為陰性/低表達；將++、+++歸為陽性/高表達。CD34單抗標記血管內(nèi)皮細胞，陽性染色部位在胞膜。微血管計數(shù)參照Weidner[3]的方法進行：顯微鏡下選定5個熱點區(qū)(血管內(nèi)皮細胞密集的區(qū)域)，高倍鏡下計數(shù)微血管數(shù)，求其平均值為MVD。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Spearman秩進行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)膜癌組與正常內(nèi)膜組HIF-1α、VEGF及MVD表達水平比較 HIF-1α、VEGF在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性高表達顯色清晰。子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α、VEGF的陽性表達率分別為54.17%(26/48)、75.00%(36/48)，與相應(yīng)的正常子宮內(nèi)膜組織陽性表達率6.67%(1/15)、13.33%(2/15)相比差異均具有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=10.529、18.157，P＜0.01)。子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜組織中MVD計數(shù)分別為(35.51±21.36)條、(3.66±4.52)條，兩組比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義(t=9.662，P＜0.01)。

2.2 HIF-1α、VEGF陽性表達及MVD測定與子宮內(nèi)膜癌臨床病理各參數(shù)的關(guān)系 在子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1和VEGF與患者的年齡、臨床分期、肌層浸潤程度無關(guān)(P＞0.05)，與組織分化程度有關(guān)(P＜0.05)。MVD與年齡、組織分化程度、臨床分期、肌層浸潤程度均有相關(guān)性(均P＜0.05)，見表1。

表1 HIF-1α和VEGF陽性表達及MVD測定與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α、VEGF表達及其與MVD的相關(guān)性 經(jīng)過Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：HIF-1α與VEGF的表達呈正相關(guān)(r=0.485，P=0.021)；HIF-1α的表達與MVD呈正相關(guān)(r=0.680，P=0.045)；VEGF的表達與MVD亦呈正相關(guān)(r=0.423，P=0.035)。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后較差。研究表明，惡性腫瘤常處于缺氧微環(huán)境中，而細胞對缺氧環(huán)境適應(yīng)性改變主要是促進腫瘤組織血管的形成及成熟。因此，切斷腫瘤的血供、阻止血管形成可導(dǎo)致腫瘤細胞壞死并抑制腫瘤的生長[4]。HIF-1α是在缺氧環(huán)境下存在于人和哺乳動物體內(nèi)的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)包括VEGF在內(nèi)的眾多靶基因的表達。HIF-1α的表達水平增高，使腫瘤細胞耐受缺氧，從而促進腫瘤生長、浸潤與轉(zhuǎn)移。大量文獻報道顯示，HIF-1α與宮頸癌、乳腺癌以及食管癌等眾多惡性腫瘤的臨床預(yù)后不佳有著緊密的關(guān)聯(lián)。VEGF是腫瘤組織中促血管生成最強的血管生長因子，是衡量癌癥轉(zhuǎn)移和預(yù)后的一個獨立指標。HIF-1α通過激活促血管生成因子來開啟血管生成，從而使腫瘤從休眠期進入血管形成期[5]。一旦新的血管形成，其會把氧輸送于腫瘤細胞，使腫瘤得以生長，甚至會促使腫瘤細胞進入機體血液而轉(zhuǎn)移到其他組織中。因此，HIF-1α與VEGF水平高表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究應(yīng)用IHC法檢測HIF-1α和VEGF在48例子宮內(nèi)膜癌組織和15例正常子宮內(nèi)膜組織中的表達情況。結(jié)果顯示，48例子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α和VEGF均有高表達，與正常子宮內(nèi)膜組織中的表達有顯著差異。Siveridis等[6]對81例G1期子宮內(nèi)膜癌組織檢測顯示，有49%表達HIF-1α，主要位于胞漿或胞核，與VEGF上調(diào)、微血管密度增高相關(guān)。同樣有研究表明肺癌、結(jié)腸癌、骨癌、乳腺癌等多種癌癥中，均有不同程度的HIF-1α的表達[7]，而腫瘤附近的正常組織區(qū)域以及良性腫瘤卻未見HIF-1α的表達。研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中，HIF-1α與患者的年齡、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小無關(guān)[8]。而本研究結(jié)果中，HIF-1α、VEGF的表達與患者年齡、臨床分期、肌層浸潤程度無關(guān)，與組織分化程度密切相關(guān)。此結(jié)果與上述文獻報道有一定的出入，分析原因可能與標本選擇的局限性造成統(tǒng)計差異有關(guān)。另外本研究顯示，在子宮內(nèi)膜癌中26例HIF-1α陽性表達中VEGF也呈現(xiàn)陽性表達，Spearman相關(guān)分析顯示HIF-1α與VEGF表達呈顯著正相關(guān)，與Buchler等[9]報道一致。

MVD是近年來研究的一個熱點，是反映腫瘤惡性生物學行為的一項重要指標，能準確反映腫瘤血管生成。隨著腫瘤組織中MVD增加，其侵襲轉(zhuǎn)移等惡性潛能也明顯增加。本研究結(jié)果顯示：MVD測定值在子宮內(nèi)膜癌組織中與正常組織中差異顯著，且與子宮內(nèi)膜癌患者的年齡、分化程度、臨床分期、肌層浸潤程度均有相關(guān)性，與HIF-1α和VEGF的表達呈顯著正相關(guān)性，提示MVD檢測可以評估腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性生物學行為。

本組研究中，子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α、VEGF表達和MVD均呈正相關(guān)，因此我們認為HIF-1α與VEGF都可以作為子宮內(nèi)膜癌的腫瘤標志物。兩者聯(lián)合檢測可以反映子宮內(nèi)膜癌的生物學行為，能夠判斷子宮內(nèi)膜癌惡性潛能及預(yù)后，也可為癌癥的早期診斷及病理分級提供重要參考依據(jù)，同時也有助于抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)。

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[4]秦承東,任正剛,湯釗猷.缺氧微環(huán)境在腫瘤進展中的作用[J].腫瘤,2016,36(1):96-102.

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Expression of HIF-1 α and VEGF in endometrial carcinoma and its correlation with tumor angiogenesis.

LI Jun-xiang1,HU Jin-tian1,GENG Jing2,LIU Yan-zhu3,ZHANG Su-jun4,YANG Jun-peng5,WANG Xiao-hua6. 1.Department of Clinical Laboratory,the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei, CHINA;2.Department of Dermatology,the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei, CHINA;3.Department of Clinical Laboratory,Shexian County Hospital of Traditional Chinese Medicine,Handan 056400, Hebei,CHINA;4.Department of Pediatrics,Shexian County Hospital of Traditional Chinese Medicine,Handan 056400, Hebei,CHINA;5.The First Department,Handan Health Supervision Institute,Handan 056001,Hebei,CHINA;6. Department of Biology,Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei,CHINA

ObjectiveTo explore and discuss the expression of hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in endometrial carcinoma as well as their correlations with tumor angiogenesis.MethodsFrom February 2012 to December 2015,48 patients of endometrial cancer(endometrial cancer group)were selected from the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,and 15 patients of normal endometrium(normal endometrium group)were selected at the same time.The HIF-1α and VEGF expression in endometrial tissue samples of the two groups were analyzed by immunohistochemistry streptavidin-peroxidase(SP)method.Vascular endothelial cells were labeled with CD34 antibody,and microvessel density(MVD)values were measured.The expression of HIF-1α,VEGF in endometrial carcinoma tissue and its clinical parameters and MVD were analyzed.ResultsThe high expression rates of HIF-1α and VEGF in the tissue of endometrial cancer group were 54.17%,75.00%,which were significantly higher than those in normal endometrium group of 6.67%,13.33%,with statistically significant differences between the two groups(P＜0.01).The MVD counts of endometrial cancer group and normal endometrium group were (35.51±21.36),(3.66±4.52),and the difference between the two groups was statistically significant(P＜0.01).In endometrial cancer group,the expression of HIF-1α and VEGF was not related to the age of patient,the clinical stage and the degree of muscular invasion(P＞0.05),but related to the degree of tissue differentiation(P＜0.05).MVD was related to theage of patient,the degree of tissue differentiation,clinical stage,the degree of muscle invasion(P＜0.05).There were positive correlations between the expression of HIF-1α and VEGF(r=0.485,P=0.021),HIF-1α and MVD(r=0.680,P= 0.045),VEGF and MVD(r=0.423,P=0.035).ConclusionHigh level expression of HIF-1α and VEGF in endometrial carcinoma is closely related to tumor angiogenesis,which can be used as a tumor marker for endometrial cancer,and provides a new direction for clinical anti-tumor therapy.

Endometrial carcinoma;Hypoxia-inducible factor-1α;Vascular endothelial growth factor;Immunohistochemistry;Micro-vessel density

R737.33

A

1003—6350（2016）23—3828—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.014

2016-06-24)

栗軍香。E-mail：lijunxiang11235@163.com