劉興暉，徐鳳霞，宋惠，魯作華，沈振華

(上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗科，上海 200135)

乙型肝炎病毒對SOX4表達(dá)的影響及其機(jī)制探討

劉興暉，徐鳳霞，宋惠，魯作華，沈振華

(上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗科，上海 200135)

目的 觀察乙型肝炎病毒(HBV)對SOX4表達(dá)的影響，并探討其機(jī)制。方法RT-PCR和Western印跡法檢測HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中SOX4 mRNA和蛋白表達(dá)的差異，將HBV感染性克隆pHBV1.3及其空載體分別與含SOX4基因啟動子的報告質(zhì)粒pGL3-SOX4共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，測定熒光色素酶的活性，RT-PCR和Western印跡法分別檢測SOX4 mRNA和蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果HepG2.2.15細(xì)胞中SOX4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于HepG2，HBV能夠激活SOX4基因啟動子的活性，并在mRNA和蛋白水平上調(diào)SOX4的表達(dá)。結(jié)論HBV能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)SOX4的表達(dá)。

乙型肝炎病毒；SOX4；啟動子；表達(dá)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康。我國是世界上HCC死亡率最高的國家，占世界上肝癌總死亡人數(shù)的53%[1]。乙肝病毒(HBV)感染是HCC的主要誘因之一，但其致病機(jī)制不明。SOX基因家族是一類在HMG基因保守區(qū)與性別決定基因(SRY)有60%以上同源性的編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因總稱，SOX4基因?qū)儆谠摮蓡T中的C亞族，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。本研究主要觀察HBV對SOX4的調(diào)節(jié)作用，并初步探討其調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，為揭示HBV致HCC奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞系及HBV感染性克隆pHBV1.3由本室保存[3]；Trizol R和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin2000購自Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和熒光色素酶底物購自Promega公司；含SOX4基因啟動子的報告質(zhì)粒pGL3-SOX4由本室構(gòu)建；抗人SOX4單克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、溫度37℃恒溫的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HepG2細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，將HBV感染性克隆pHBV1.3、pGL3-SOX4和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin2000分別稀釋在無雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，室溫作用20 min，將配制好的轉(zhuǎn)染液加細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 RT-PCR檢測 Trizol R試劑提取細(xì)胞總RNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，用SOX4基因的檢測引物5'-CAAGCACCTGGCGGAGAAGA-3'(上游引物)，5'-GGAGGAAGAGGAGGAGTGGGAC-3'(下游引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時設(shè)立β-actin作為內(nèi)參，擴(kuò)增25個循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 Western印跡法檢測 收集HepG2細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后加上樣緩沖液，12% SDS-PAGE進(jìn)行分離，再將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素NC膜上，脫脂牛奶封閉，1:2 000加入抗人SOX4單克隆抗體，1:5 000加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗溫育，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)進(jìn)行顯色。

1.2.5 熒光素酶的測定 收集HepG2細(xì)胞，加入100 μL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，取20 μL裂解后的細(xì)胞和50 μL熒光色素酶底物，充分混勻，用Luminometer測定光密度。

2 結(jié) 果

2.1 HBV在HepG2.2.15細(xì)胞上調(diào)SOX4 mRNA和蛋白的表達(dá) 在前期的工作中，采用基因芯片技術(shù)，我們篩選到SOX4在整合了HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平較HepG2高[3]，進(jìn)一步采用RT-PCR和Western blot對芯片結(jié)果進(jìn)行了驗證，檢測結(jié)果如圖1和圖2所示，與對照細(xì)胞HepG2相比，HepG2.2.15細(xì)胞中SOX4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平升高。

圖1 SOX4 mRNA在HepG2.2.15和HepG2中表達(dá)的差異

圖2 SXO4蛋白在HepG2和HepG2.2.15中表達(dá)的差異

2.2 HBV激活SOX4基因啟動子的活性 為探討HBV上調(diào)SOX4表達(dá)的分子機(jī)制，我們將HBV感染性克隆pHBV1.3與含SOX4基因啟動子的報告質(zhì)粒pGL3-SOX4共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載體pBlue-ks作為對照，通過測定熒光素酶的活性的變化來檢測HBV對SOX4基因啟動子調(diào)節(jié)。結(jié)果如圖3所示，與對照相比[(178.6±18.5)RUL/μg蛋白]，轉(zhuǎn)染pHBV1.3后熒光素酶活性[(673.7±36.3)RUL/μg蛋白]明顯升高，表明HBV能夠激活SOX4基因啟動子的活性。

圖3 HBV對SOX4基因啟動子活性的調(diào)節(jié)作用

2.3 HBV在HepG2細(xì)胞上調(diào)SOX4 mRNA和蛋白的表達(dá) 為進(jìn)一步探討HBV調(diào)節(jié)SOX4表達(dá)的分子機(jī)制，我們將HBV感染性克隆pHBV1.3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載體pBlue-ks作為對照，采用RT-PCR和Western blot檢測SOX4的表達(dá)。結(jié)果如圖4和圖5所示，與對照相比，轉(zhuǎn)染pHBV1.3后的SOX4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高。

圖4 pHBV1.3對SOX4 mRNA表達(dá)的影響

圖5 pHBV1.3對SOX4蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肝癌是五大常見癌癥之一，也是三大高致死率的癌癥之一。肝癌的誘發(fā)因素很多，包括HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、黃曲霉素和酒精等。在中國，90%左右的肝癌患者伴有HBV感染。在全球范圍內(nèi)，約20億人感染或者感染過HBV，其中2.4億人是HBV慢性感染者，每年大約有65萬人死于HBV感染引起的肝硬化和肝癌[4-5]。

SOX4是SoxC家族成員之一，其分子量大小為47 000。SOX4主要作為轉(zhuǎn)錄因子行使其功能，N端包含一個Sry相關(guān)的HMG box DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠高效、特異性結(jié)合靶基因啟動子序列AACAAAG的DNA結(jié)構(gòu)域；其C端含有一個反式激活結(jié)構(gòu)域，激活下游基因的表達(dá)，在胚胎發(fā)育、器官形成、細(xì)胞生長以及腫瘤發(fā)生、遷移中發(fā)揮重要功能[2]。

本研究中，我們采用RT-PCR和Western blot檢測了感染HBV全基因組的細(xì)胞系HepG2.2.15及其對照細(xì)胞HepG2中SOX4 mRNA和蛋白的差異，發(fā)現(xiàn)HepG2.2.15細(xì)胞中SOX4的表達(dá)明顯高于HepG2，與前期工作中的基因芯片結(jié)果一致[3]，為深入探討HBV調(diào)節(jié)SOX4表達(dá)的分子機(jī)制，筆者分別在啟動子、mRNA和蛋白水平檢測了HBV感染性克隆pHBV1.3對SOX4表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)SOX4的表達(dá)，證實HBV是通過激活SOX4啟動子的活性來上調(diào)SOX4的表達(dá)。

研究表明，SOX4作為致癌因子，與胃癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切關(guān)聯(lián)，例如，與正常人組織相比，膀胱癌中SOX4表達(dá)上調(diào)了5倍[6]。此外，SOX4蛋白能夠直接與抑癌基因p53相互作用，從而抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7]。在肝癌的發(fā)生過程中，SOX4能夠調(diào)控下游基因semaphorin 3C和neuropilin1的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和入侵，并且與細(xì)胞的增殖率和存活率相關(guān)[8]。因此，HBV可能通過上調(diào)SOX4來促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，HBV對SOX4表達(dá)是有調(diào)節(jié)作用，但HBV是通過哪個基因上調(diào)SOX4的表達(dá)，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制如何？有待進(jìn)一步研究。

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Effect and regulatory mechanism of hepatitis B virus on the expression of SOX4.

LIU Xing-hui,XU Feng-xia, SONG Hui,LU Zuo-hua,SHEN Zhen-hua.Department of Clinical Laboratory,Shanghai Pudong New Area Gongli Hospital,Shanghai 200135,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of hepatitis B virus(HBV)on the expression of SOX4 and its regulatory mechanism.MethodsThe expression of SOX4 mRNAand protein in HepG2 and HepG2.2.15 cells was measured by RT-PCR and Western blot.HBV infectious clone pHBV1.3 and its empty vector were co-transfected into HepG2 cells with reporter plasmid pGL3-SOX4 containing SOX4 gene promoter.The luciferase activity was measured, and expression of SOX4 mRNA and protein were measured by RT-PCR and Western blot.ResultsThe expression of SOX4 mRNA and protein was higher in HepG2.2.15 cells than in HepG2 cells.HBV could activate the activity of SOX4 promoter,and the expression of SOX4 were upregulated at mRNA and protein level.ConclusionHBV can upregulate the expression of SOX4 both at the transcription and translation level.

Hepatitis B virus(HBV);SOX4;Promoter;Expression

R512.6+2

A

1003—6350（2016）23—3811—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.008

2016-07-11)

上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助（編號：PWZx2014－03）；病毒學(xué)國家重點(diǎn)實驗室開放研究基金（編號：2015KF002）

劉興暉。E-mail：syliuxh@163.com