王春芳，劉兵，孫光，徐瑜杰，彭勃

(?？谑腥嗣襻t(yī)院胃腸外科，海南 ?？?570208)

二甲雙胍影響人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究

王春芳，劉兵，孫光，徐瑜杰，彭勃

(海口市人民醫(yī)院胃腸外科，海南 海口 570208)

目的 探討二甲雙胍對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法二甲雙胍處理體外常規(guī)培養(yǎng)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15、COLO205，通過MTT檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長活力；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期及凋亡；Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bad、Bcl-2、Cleaved caspase-3及信號(hào)通路蛋白Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、S6K、p-S6K的表達(dá)變化。結(jié)果不同濃度的二甲雙胍作用HCT-15、COLO205細(xì)胞72 h后細(xì)胞活力明顯受到抑制，并呈現(xiàn)濃度依賴性；經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析，二甲雙胍能夠促使細(xì)胞停滯于G0/G1期，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞早期及晚期凋亡所占比率；Western blot分析發(fā)現(xiàn)，Bad、cleaved caspase-3表達(dá)量隨著二甲雙胍濃度的升高而上調(diào)，Bcl-2表達(dá)量隨著二甲雙胍濃度升高而下降；同時(shí)，p-Akt及p-mTOR、p-S6K的表達(dá)量均明顯被抑制，但Akt、mTOR、S6K總蛋白表達(dá)量無明顯變化。結(jié)論二甲雙胍能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而具體機(jī)制可能與抑制Akt及mTOR通路活性有關(guān)。

二甲雙胍；結(jié)直腸癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

人類消化道惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)病率較高，僅次于食管癌和胃癌。由于受到遺傳、環(huán)境和生活方式等相關(guān)因素的影響，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加趨勢(shì)，成為中國致死率較高的腫瘤之一。結(jié)直腸癌患者中早期癥狀較為隱蔽，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處中晚期。單純手術(shù)治療后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高；手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療是中晚期直腸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療模式[1]，但其毒副作用及個(gè)體的耐受性限制腫瘤治療的療效。

二甲雙胍(metformin)是廣泛治療Ⅱ型糖尿病的一線藥物。最近發(fā)現(xiàn)，其同樣具有抗腫瘤的作用[2]。二甲雙胍能夠降低乳腺癌[3-4]、腸癌[5]及胰腺癌[6]生長。但是，具體的作用機(jī)制不詳。本研究利用二甲雙胍分別干預(yù)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15及COLO205細(xì)胞，檢測二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響并初步探討可能作用機(jī)制，為二甲雙胍更好地應(yīng)用于臨床輔助治療結(jié)直腸癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15、COLO205購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；二甲雙胍購自于美國Sigma-Aldrich公司；MTT、Annexin V-FITC/PI試劑盒、RIPA組織細(xì)胞快速裂解液購自于碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶購自美國HYCLONE公司；硝酸纖維素膜、發(fā)光液為美國Millipore公司；X光膠片購自伊士曼柯達(dá)公司；Anti-pan-AKT antibody、Anti-pan-AKT(phospho T308)antibody、Anti-Bax antibody、Anti-Bcl-2 antibody、Anti-p27、Anti-cleaved-caspase-3、Anti-S6K、Anti-S6K(phospho T389)購自英國Abcam公司；GAPDH(14C10)Rabbit mAb購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自武漢Proteintech公司；其他常用生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱及Multiskan spectrum全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀BD FACSCalibur購自于美國BD公司；超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；電泳儀、電轉(zhuǎn)移購自美國Bio-Rad公司；水浴鍋購自德國Leica公司；暗匣購自深圳市富明威實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15、COLO205利用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)37℃、5%CO2培養(yǎng)。細(xì)胞長至對(duì)數(shù)生長期，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，0.25%胰蛋白酶消化，加培養(yǎng)液吹打均勻成單細(xì)胞懸液，按1:3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測 HCT-15、COLO205細(xì)胞傳于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。分別加入0、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L二甲雙胍分別處理72 h，每組設(shè)置5復(fù)孔。每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清。每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。全波長多功能酶標(biāo)儀測定570 nm波長下每孔的吸光值(OD)，以DMSO調(diào)零，按公式求出各組細(xì)胞的活力=(實(shí)驗(yàn)組平均OD值-空白組平均OD值)/(對(duì)照組平均OD值-空白組平均OD值)×100%。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測 HCT-15、COLO205細(xì)胞分別設(shè)置：空白對(duì)照組、二甲雙胍處理組(5 mmol/L、10 mmol/L)，作用48 h。收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，吸取上清液；PBS重懸漂洗細(xì)胞；緩慢加入700 μL預(yù)冷的乙醇，使乙醇終濃度為70%；4℃固定過夜；1 000 r/min離心5 min，預(yù)冷PBS漂洗2次；加入100 μL RNaseA(50 μg/mL)，37℃水浴30 min；加入400 μL PI(50 μg/mL)，4℃避光染色30 min；流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測 HCT-15、COLO205細(xì)胞分別設(shè)置：空白對(duì)照組、二甲雙胍處理組(5 mmol/L、10 mmol/L)，作用48 h。收集細(xì)胞，加入Annexin V-FITC及PI染色，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.5 Western blot檢測 HCT-15、COLO205細(xì)胞分別設(shè)置：空白對(duì)照組、二甲雙胍處理組(5 mmol/L、10 mmol/L)，電泳，半干式電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜后，封閉緩沖液(含5%脫脂奶粉TBST)，室溫封閉1 h，浸于一抗(Akt，1:500、p-Akt，1:500、Bax，1:1 000、Bcl-2，1:800、p27，1:800、cleaved caspase-3，1:800、CyclinD1，1:1 200、S6K，1:1 000、p-S6K，1:500、mTOR，1:800、p-mTOR，1:500)4℃孵育過夜，加羊抗兔二抗(1:10 000)37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，采用ECL發(fā)光顯影，并用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖影響 不同的濃度二甲雙胍(5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L)作用HCT-15及COLO205細(xì)胞不同濃度72 h后MTT檢測細(xì)胞活力，與對(duì)照組比較細(xì)胞活力明顯下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說明二甲雙胍能夠有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，見圖1。

圖1 不同濃度的二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力的影響

2.2 二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期影響 利用5 mmol/L、10 mmol/L的二甲雙胍分別作用結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15、COLO205細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測周期分布變化。HCT-15對(duì)照組G1/G0期細(xì)胞所占比率為(42.31±0.28)%、5 mmol/L二甲雙胍處理組G1/G0期細(xì)胞所占比率為(56.65±0.54)%、10 mmol/L二甲雙胍處理組G1/G0期細(xì)胞所占比率為(68.92±0.39)%，與對(duì)照組比較，5 mmol/L、10 mmol/L的二甲雙胍組極顯著上調(diào)G0/G1期比率(P＜0.01)。二甲雙胍作用與COLO205細(xì)胞的效應(yīng)與HCT-15類似。說明二甲雙胍能夠引起結(jié)直腸癌細(xì)胞G0/G1期停滯，見圖2。

2.3 二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡影響 5mmol/L、10 mmol/L的二甲雙胍分別作用結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15、COLO205細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比率變化。HCT-15細(xì)胞對(duì)照組早期凋亡細(xì)胞所占比率為(4.11±0.21)%，5 mmol/L早期凋亡細(xì)胞所占比率為(22.83±0.49)%，10 mmol/L早期凋亡細(xì)胞所占比率為(47.97±0.35)%，與對(duì)照組比較，5 mmol/L、10 mmol/L的二甲雙胍組極顯著上調(diào)細(xì)胞早期凋亡比率(P＜0.01)，并具有濃度依賴性；二甲雙胍作用與COLO205細(xì)胞的效應(yīng)與HCT-15類似，見圖3。

2.4 二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)影響 5 mmol/L、10 mmol/L的二甲雙胍分別作用結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15、COLO205細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白，通過Western blot檢測周期蛋白p27及CyclinD1的表達(dá)。與對(duì)照組比較，CyclinD1的表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)，p27的表達(dá)量顯著升高(P＜0.01)，并呈現(xiàn)濃度依賴性，見圖4。

圖2 二甲雙胍作用48 h后結(jié)直腸癌細(xì)胞周期分布

圖3 二甲雙胍作用48 h后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響

圖4 二甲雙胍作用48 h對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響

2.5 二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞Akt及mTOR信號(hào)通路活性影響 二甲雙胍作用結(jié)直腸癌細(xì)胞48 h后，利用Western blot檢測mTOR及Akt信號(hào)通路主要蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照組比較，p-Akt的表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)，而Akt總蛋白的表達(dá)量無顯著變化(P＞0.05)；p-mTOR及p-S6K的表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)，而mTOR及S6K總蛋白的表達(dá)量無顯著變化(P＞0.05)。

2.6 二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響 Western blot檢測結(jié)果如圖6所示。與對(duì)照組比較，促凋亡蛋白Bad的表達(dá)量顯著升高(P＜0.01)；抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)；Cleaved caspase-3的表達(dá)量顯著升高(P＜0.01)；說明二甲雙胍能夠引起細(xì)胞凋亡效應(yīng)。

圖5 二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞Akt及mTOR信號(hào)通路的影響

圖6 二甲雙胍作用48 h，對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

二甲雙胍是一種口服雙胍類藥物，廣泛應(yīng)用于治療Ⅱ型糖尿病患者已經(jīng)超過40多年的歷史，具有很好的治療效果及成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。除了用于治療糖尿病以外，流行病學(xué)研究及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍同樣能夠降低糖尿病患者罹患癌癥風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。此外，大量的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明，二甲雙胍能夠提高腫瘤患者的生存期[9-10]。這種效應(yīng)與二甲雙胍能夠激活mTOR抑制劑AMPK通路有關(guān)[11]。

本研究通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度的二甲雙胍作用人結(jié)直腸癌細(xì)胞72 h后細(xì)胞活力明顯受到抑制，并且呈現(xiàn)濃度依賴性。同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，5 mmol/L、10 mmol/L二甲雙胍作用結(jié)直腸癌細(xì)胞48 h后能夠顯著抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞G0/G1期停滯。進(jìn)一步Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，p27蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，而CyclinD1的表達(dá)量顯著下調(diào)；同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠顯著上調(diào)凋亡細(xì)胞所占比率。

CyclinD1在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[12-13]，并且和腫瘤的生長及耐藥相關(guān)[14]。研究認(rèn)為，周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases，Cdks)抑制劑如p27能夠?qū)苟纂p胍對(duì)細(xì)胞的影響[15]。本研究通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠下調(diào)CyclinD1的表達(dá)，上調(diào)p27的表達(dá)量。說明二甲雙胍抑制結(jié)直腸癌增殖作用可能與p27及CyclinD1有關(guān)。

Akt信號(hào)通路在機(jī)體起到重要的作用，發(fā)揮多種的磷酸化功能，調(diào)節(jié)包括細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞生存、蛋白合成、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為[16-17]?；罨腁kt可調(diào)節(jié)mTOR，mTOR進(jìn)一步調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白GSK3β、S6K、4EBP1、Cleaved Caspase-3[18]，最終通過Caspase-3引起細(xì)胞凋亡[19-20]。本研究通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠顯著降低Akt、mTOR及S6K的磷酸化，但總的蛋白表達(dá)水平無明顯變化。說明二甲雙胍能夠降低Akt、mTOR信號(hào)通路的活性，最終引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，二甲雙胍能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，上調(diào)細(xì)胞凋亡比率，促進(jìn)細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1停滯。其作用機(jī)制可能與Akt及mTOR信號(hào)通路被抑制有關(guān)，但具體的機(jī)制需要更進(jìn)一步的研究。深入探討二甲雙胍對(duì)結(jié)直腸癌的作用機(jī)制，對(duì)臨床上更好利用二甲雙胍輔助治療結(jié)直腸癌具有重要意義。

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Mechanism of metformin on the cell proliferation and apoptosis of human colorectal cancer cells.

WANG Chun-fang,LIU Bing,SUN Guang,XU Yu-jie,PENG Bo.Department of Gastrointestinal Surgery,Haikou People's Hospital,Haikou 570208,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the effect of metformin on cell proliferation and apoptosis of human colorectal cancer and to explore the potential mechanism.MethodsHuman colorectal cancer cell HCT-15 and COLO205 were cultured and treated with metformin in vitro.The cell viability was assessed by MTT assay,and the cell cycle and apoptosis were tested by flow cytometry.Western blot assay was performed to analyze the changed expression of apoptosis-related proteins(Bad,Bcl-2,cleaved caspase-3),Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR,S6K,p-S6K.ResultsMTT assay showed metformin could significantly inhibit cell proliferation of HCT-15 cells and COLO205 cells in a dose-dependent manner after 72 h.Meanwhile,metformin could induce G0/G1 arrest,and increase the rate of apoptosis cell.The results of Western blot showed that the expression of Bad and cleaved caspase-3 were significantly increased by metformin treatment,and the expression of Bcl-2 was significantly decreased.Furthermore,the phosphorylation of AKT,mTOR and S6K(p-Akt,p-mTOR,p-S6K)were significantly inhibited,but the total protein expression of AKT,mTOR and S6K were not significantly changed.ConclusionMetformin could inhibit the proliferation of human colorectal cancer cell, and induce the apoptosis via inhibiting the activity ofAkt and mTOR.

Metformin;Colorectal cancer;Cell proliferation;Cell apoptosis

R735

A

1003—6350（2016）23—3802—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.006

2016-06-27)

彭勃。E-mail：pengbohk2016@163.com