謝茂云，黃耀，楊莉濤，王新根

(中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院普通外科，廣東 深圳 518033)

PDCD4對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞調(diào)亡及成瘤能力的影響

謝茂云，黃耀，楊莉濤，王新根

(中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院普通外科，廣東 深圳 518033)

目的 研究程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)誘導(dǎo)的對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞凋亡效應(yīng)及抑制成瘤能力的可能作用機(jī)制。方法將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為兩組，觀察組先予以PDCD4凋亡相關(guān)基因Bax的刺激14 h進(jìn)行細(xì)胞的收集，然后加入tPA刺激細(xì)胞進(jìn)行收集。對(duì)照組未加PDCD4凋亡相關(guān)基因Bax的刺激和tPA刺激。應(yīng)用AnnexinV/PI和API等標(biāo)記，Cyclins/DNA雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測(cè)甲狀腺癌SW579細(xì)胞的凋亡及周期特異性，運(yùn)用RT-PCR的方法檢查Caspase-3、Caspase-9活化情況。結(jié)果處于靜止期的外周血對(duì)PDCD4凋亡誘導(dǎo)不敏感，而G1期PDCD4誘導(dǎo)甲狀腺癌SW579細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡。PDCD4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要是在細(xì)胞周期的G1期發(fā)生。觀察組的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)值分別為(1.12±0.56)、(1.10±0.29)，顯著高于對(duì)照組的(0.82±0.31)、(0.72±0.26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論P(yáng)DCD4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與甲狀腺癌SW579細(xì)胞的細(xì)胞周期相關(guān)，存在G1期細(xì)胞周期阻滯的周期特異性，且此過(guò)程中發(fā)生了Caspase活化，參與細(xì)胞凋亡及可能抑制細(xì)胞成瘤能力。

程序性細(xì)胞死亡因子4；甲狀腺癌SW579細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；成瘤能力

甲狀腺癌約占全身惡性腫瘤的1%，近年來(lái)，甲狀腺癌發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，甲狀腺癌多起病隱匿，常以無(wú)痛性甲狀腺結(jié)節(jié)為最初臨床表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制不明確，早期診斷較為困難。因此，研究其可能的發(fā)病機(jī)制及早期診斷預(yù)警分子，是目前甲狀腺癌臨床研究所面臨的瓶頸問(wèn)題，而程序性細(xì)胞死亡因子4 (programmed cell death 4，PDCD4)是新近發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，其已被證實(shí)為是一種腫瘤抑制蛋白[1-3]。已有不少研究表明PDCD4在惡性腫瘤中較正常組織表達(dá)下調(diào)或缺失[4-5]，但具體機(jī)制不是十分明確。本研究的總體研究思路是通過(guò)細(xì)胞分子試驗(yàn)，以期探討PDCD4抗甲狀腺癌SW579細(xì)胞凋亡的效應(yīng)、分子機(jī)制以及對(duì)成瘤能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 (1)試劑：甲狀腺癌SW579細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，DMEM培養(yǎng)液(U.S. Promega Biological Technology CO.，Ltd.)，PCR試劑盒(北京索萊寶)，流式細(xì)胞檢測(cè)用AV/PI雙染、PI單染試劑購(gòu)于上海索萊寶生物科技有限公司。甲狀腺癌SW579細(xì)胞中組織型纖溶酶原激活劑tPA(上海碧云天生物)。(2)儀器：細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)(蘇州凈化)，恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Beckman Coulter公司)，PCR儀(德國(guó)Biometra公司)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，全自動(dòng)低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)，F(xiàn)ACSort流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 甲狀腺癌SW579細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃孵箱中傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4×106以上的時(shí)候進(jìn)行傳代，去除舊培養(yǎng)基，加入0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶使其完全覆蓋細(xì)胞，室溫消化3～5 min，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)大部分細(xì)胞胞質(zhì)回縮變圓時(shí)，吸去胰蛋白酶。加入新鮮的完全培養(yǎng)基，吹打貼壁細(xì)胞使之成為細(xì)胞混懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)比例稀釋并移至另一滅菌培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，密切觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.3 細(xì)胞處理與分組 待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至4×106，對(duì)數(shù)是生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為兩組，觀察組先予以PDCD4凋亡相關(guān)基因Bax的刺激14 h進(jìn)行細(xì)胞的收集，然后加入tPA刺激細(xì)胞進(jìn)行收集。對(duì)照組未加PDCD4凋亡相關(guān)基因Bax的刺激和tPA刺激。

1.4 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)取甲狀腺癌SW579細(xì)胞定量100 mg，提取總RNA，-80℃，保存，備用。取2 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄cDNA，-20℃，保存cDNA。人PDCD4基因引物：上游5'-TCA GCG ACA GTG GGA GT-3'，下游5'-AGC ACG GTA GCC TTA TC-3'，PCR反應(yīng)由逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 2 μL以及18sRNA和Caspase-3、Caspase-9的引物共同組成。反應(yīng)過(guò)程按照標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR步奏進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)熱3 min，95℃、12 s，60℃、40 s，40個(gè)循環(huán)。接著對(duì)所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，90～100 V，30～40 min。所得的電泳結(jié)果進(jìn)行凝膠成像分析系統(tǒng)分析。內(nèi)參選擇18sRNA作為參照，同樣完成以上PCR系統(tǒng)的成像，對(duì)得到的半定量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞的凋亡周期 采用Annexin V/PI的方法進(jìn)行凋亡的檢測(cè)，細(xì)胞離心去除培養(yǎng)基之后冷卻至4℃，進(jìn)行細(xì)胞洗滌，調(diào)整濃度至106/mL，取100 μL的細(xì)胞懸液加入Annexin V-FITC和PI，避光15 min之后進(jìn)行流式檢測(cè)。采用API的方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡周期，對(duì)收集的細(xì)胞加入Annexin V-FITC，室溫避光30 min以后用Buffer進(jìn)行洗滌2次，加入不換甲醇的甲醛1 mL進(jìn)行細(xì)胞固定，Buffer洗滌2次，加入PI染色劑，靜置1 h之后進(jìn)行流式細(xì)胞的檢測(cè)。Cyclins/DNA雙標(biāo)流式細(xì)胞儀分析甲狀腺癌SW579細(xì)胞的周期特異性，對(duì)收集的細(xì)胞采用乙醇固定過(guò)夜，將固定后的細(xì)胞用PBS沖洗2次，用TritonX-100處理5 min兩次，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，用BSA稀釋抗體，4℃過(guò)夜，第二日加用羊抗鼠IgG，室溫靜置20 min，PBS洗滌之后，加入PI和RnaseA進(jìn)行DNA染色，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，應(yīng)用Mann-whitney U檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩數(shù)據(jù)之間比較，多個(gè)來(lái)自正態(tài)總體的樣本均數(shù)之間的比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡情況 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的甲狀腺癌SW579細(xì)胞加入PDCD4誘導(dǎo)一定時(shí)間后，細(xì)胞凋亡率開(kāi)始變化，誘導(dǎo)達(dá)24 h后，凋亡細(xì)胞增加了6.8%，且短期內(nèi)隨時(shí)間推遲，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，表明PDCD4可以誘導(dǎo)甲狀腺癌SW579細(xì)胞凋亡；加入tPA刺激的甲狀腺癌SW579細(xì)胞再加入PDCD4誘導(dǎo)24 h，凋亡增加至15.2%，表明加入tPA刺激的PDCD4誘導(dǎo)的甲狀腺癌SW579細(xì)胞凋亡影響較未加入tPA刺激的凋亡效果更明顯，見(jiàn)圖1和圖2。

2.2 甲狀腺癌SW579細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期情況 檢測(cè)甲狀腺癌SW579細(xì)胞加入tPA刺激后細(xì)胞增殖的情況，結(jié)果顯示，處于靜止期的甲狀腺癌SW579細(xì)胞加入tPA以后進(jìn)入細(xì)胞周期出現(xiàn)了G2～M期的細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

2.3 細(xì)胞凋亡的細(xì)胞周期特異性 PDCD4誘導(dǎo)甲狀腺癌SW579細(xì)胞發(fā)生在G1期，PDCD4誘導(dǎo)tPA刺激的甲狀腺癌SW579細(xì)胞，細(xì)胞周期發(fā)生在G1期，對(duì)照組未加PDCD4誘導(dǎo)及tPA刺激幾乎沒(méi)有明顯的凋亡發(fā)生。

圖1 PDCD4誘導(dǎo)的甲狀腺癌SW579細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

圖2 PDCD4誘導(dǎo)的tPA刺激的甲狀腺癌SW579細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

圖3 甲狀腺癌SW579細(xì)胞刺激后細(xì)胞增殖的情況

2.4 細(xì)胞周期分析結(jié)果 甲狀腺癌SW579細(xì)胞處在G0期，tPA刺激之后出現(xiàn)在G0、早/晚G1、S2、G2、M期，加入PDCD4誘導(dǎo)之后CyclinE表達(dá)下降，細(xì)胞阻滯存在G1期。

2.5 兩組甲狀腺癌SW579細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)比較 通過(guò)PDCD4誘導(dǎo)凋亡對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞的Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)情況比較，觀察組采用PDCD4誘導(dǎo)，對(duì)照組未做處理，觀察凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示觀察組的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)值顯著高于對(duì)照組，兩組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，觀察組細(xì)胞凋亡指數(shù)逐漸升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1和表2。

表1 兩組甲狀腺癌SW579細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)比較(±s)

表1 兩組甲狀腺癌SW579細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)比較(±s)

組別mRNA對(duì)照組觀察組t值P值Caspase-3 0.82±0.31 1.12±0.56 2.48＜0.05 Caspase-9 0.72±0.26 1.10±0.29 2.62＜0.05

表2 兩組不同時(shí)相血清細(xì)胞凋亡指數(shù)變化比較(±s)

表2 兩組不同時(shí)相血清細(xì)胞凋亡指數(shù)變化比較(±s)

注：與3 h比較，aP＜0.05。

組別對(duì)照組觀察組t值P值3 h 1.50±0.35 23.84±5.19 24.32＜0.01 6 h 2.64±0.89 42.51±7.24a38.75＜0.01 12 h 2.87±0.43 52.51±8.12a47.36＜0.01 24 h 2.73±0.31 55.48±8.44a51.12＜0.01 F值2.84 74.25 P值0.075＜0.01

3 討論

甲狀腺癌是一種最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，同時(shí)甲狀腺癌的治療取得了較快的發(fā)展，但甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制目前仍尚不十分明確，PDCD4作為一種新的抑癌基因，其在甲狀腺癌中的表達(dá)水平如何？PDCD4對(duì)甲狀腺癌有什么樣的作用?能否成為甲狀腺癌治療的新靶點(diǎn)?腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，腫瘤細(xì)胞的生存凋亡與細(xì)胞周期有關(guān)，細(xì)胞周期具有高度的保守性，凋亡不會(huì)對(duì)正常機(jī)體需要的細(xì)胞產(chǎn)生威脅，但能夠?qū)Σ槐匾募?xì)胞產(chǎn)生景區(qū)的生理調(diào)控，凋亡與細(xì)胞增殖之間有著潛在相關(guān)性，細(xì)胞的凋亡具有周期性的特征，往往凋亡的發(fā)生是細(xì)胞被阻滯在細(xì)胞周期的其中一個(gè)時(shí)相當(dāng)中，然而在已有的研究中相關(guān)PDCD4誘導(dǎo)的甲狀腺癌SW579細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期特異性相關(guān)的研究尚未涉及，PDCD4是如何通過(guò)細(xì)胞周期的特異性阻滯而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的，對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9活化有何影響，本文對(duì)其凋亡及成瘤的特異性進(jìn)行了闡述。

筆者在體外對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，在未經(jīng)刺激的情況下，細(xì)胞處于G0期的狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞被PDCD4誘導(dǎo)之后，發(fā)生凋亡的細(xì)胞較少，細(xì)胞不進(jìn)入細(xì)胞周期，而在此基礎(chǔ)上采用甲狀腺癌SW579細(xì)胞中組織型纖溶酶原激活劑tPA可以激活甲狀腺癌SW579細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，促使細(xì)胞增殖，細(xì)胞進(jìn)入了S、G2/M期，細(xì)胞凋亡率大大增加了[6-7]。可見(jiàn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生只有在進(jìn)入到細(xì)胞中期之后被檢測(cè)到。細(xì)胞的凋亡是否具有周期特異性，我們通過(guò)API的方法進(jìn)行檢測(cè)PDCD4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況，在凋亡的早期細(xì)胞凋亡出現(xiàn)伴隨著膜外翻的現(xiàn)象，API的方法就是利用AnnexinV與此現(xiàn)象的相結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞核染色，對(duì)凋亡周期特異性進(jìn)行判斷，結(jié)果顯示，PDCD4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與周期特異性的凋亡主要發(fā)生在細(xì)胞周期的G1期。細(xì)胞的周期蛋白是一類(lèi)在細(xì)胞周期中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)刺激細(xì)胞周期的依賴性蛋白激酶使細(xì)胞有特異性周期表現(xiàn)，周期蛋白最大的特點(diǎn)就是時(shí)相性，CyclinE/DNA雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期的分析主要是將細(xì)胞CyclinE的表達(dá)與細(xì)胞處的位置結(jié)合分析，可以得到細(xì)胞的詳細(xì)周期信息[8]。CyclinE完全在G1期合成，G0期不會(huì)出現(xiàn)CyclinE，其中以晚G1期表達(dá)最強(qiáng)，CyclinE可以完全將G0、G1很好地分開(kāi)，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)PDCD4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞CyclinE的表達(dá)是下降的，細(xì)胞在G1期被阻滯，此過(guò)程也伴隨緩則凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9的高表達(dá)及活化。

綜上所述，甲狀腺癌SW579細(xì)胞在靜止期的時(shí)候并沒(méi)有啟動(dòng)周期進(jìn)程，進(jìn)入周期后細(xì)胞凋亡才會(huì)變得敏感，PDCD4誘導(dǎo)凋亡與甲狀腺癌SW579細(xì)胞的周期有密切關(guān)系，會(huì)發(fā)生在特定的時(shí)相中，這樣也將細(xì)胞凋亡和周期特異性做了一個(gè)很好的解釋?zhuān)瑥哪撤矫嬲f(shuō)明了凋亡的周期性。細(xì)胞凋亡在惡性腫瘤中具有重要作用，本研究對(duì)PDCD4誘導(dǎo)凋亡及抑制成瘤中做了探索性的研究，對(duì)腫瘤的誘導(dǎo)凋亡和治療來(lái)說(shuō)有一定的臨床指導(dǎo)意義，希望通過(guò)今后進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有更多的發(fā)現(xiàn)和收獲。

[1]Biyanee A,Ohnheiser J,Singh P,et al.A novel mechanism for the control of translation of specific mRNAs by tumor suppressor protein Pdcd4:inhibition of translation elongation[J].Oncogene,2014,34 (11):1384-1392.

[2]Poria DK,Guha A,Nandi I,et al.RNA-binding protein HuR sequesters microRNA-21 to prevent translation repression of proinflammatory tumor suppressor gene programmed cell death 4[J].Oncogene, 2016,35(13):1703-1715.

[3]Goke R,Barth P,Sehmidt A,et al.Pmgrammed cell death protein 4 suppresses CDKI/edc2 via induetion ofp 21(Wfll/Cipl)[J].Am J Physiol Cell Physiol,2014,286(6):1541-1546.

[4]Epis MR,Barker A,Giles KM,et al.The RNA-binding protein HuR opposes the repression of ERBB-2 gene expression by microRNA miR-331-3p in prostate cancer cells[J].J Biol Chem,2011,286(48): 41442-41454.

[5]Wang YQ,Guo RD,Guo RM,et al.MicroRNA-182 promotes cell growth,invasion,and chemoresistance by targeting programmed cell death 4(PDCD4)in human ovarian carcinomas[J].J Cell Biochem, 2013,114(7):1464-1473.

[6]Yang J,Eckert MA.Targeting invadopodia to block breast cancer metastasis[J].Oncotarget,2011,2(7):562-568.

[7]Pinho AV,Rooman I,Real FX.p53-dependent regulation of growth, epithelial mesenchymal transition and stemness in normal pancreatic epithelial cells[J].Cell Cycle,2011,10(8):1312-1321.

[8]Wallerand H,Robert G,Pasticier G,et al.The epithelial-mesenchymal transition inducing factor TWIST is an attractive target in advanced and/or metastatic bladder and prostate cancers[J].Urol Oncol,2010,28(5):473-479.

Effect of PDCD4 on apoptosis and tumorigenic capacity of SW579 thyroid cancer cells.

XIE Mao-yun,HUANG Yao, YANG Li-tao,WANG Xin-gen.Department of General Surgery,the Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen Uiniversity, Shenzhen 518033,Guangdong,CHINA

Objective To study the mechanism of programmed cell death 4(PDCD4)-induced apoptosis and inhibition of tumorigenic capacity in SW579 thyroid cancer(TC)cells.MethodsSW579 thyroid cancer cells in logarithmic growth phase were divided into two groups.Cells in the observation group were stimulated by PDCD4 apoptosis-related gene Bax for 14 hours and then by tPAfor collection.Cells in the control group did not received stimulation by Bax and tPA.AnnexinV/PI,API markers and Cyclins/DNA flow cytometry were used to check apoptosis and cycle specificity of SW579 cells.RT-PCR was applied to check the activation conditions of Caspase-3,Caspase-9.ResultsSW579 cells of peripheral blood in stationary phase were not sensitive to PDCD4 induction,while those in G1phase showed significant apoptosis under PDCD4 induction.PDCD4-induced apoptosis mainly occurred in the G1phase.The expression levels of Caspase-3,Caspase-9 mRNA in the observation group were(1.12±0.56),(1.10±0.29),which were significantly higher than those in the control group of(0.82±0.31),(0.72±0.26),P＜0.05.ConclusionPDCD4-induced apoptosis of SW579 cells is related to cell cycle,with cycle specificity of cell cycle arrest in G1phase.During the cell cycle arrest,Caspase activation occurred and is involved in the apoptosis and inhibition of tumorigenic capacity.

Programmed cell death 4(PDCD4);SW579 thyroid cancer cell;Apoptosis;Cell cycle;Tumorigenic capacity

R736.1

A

1003—6350（2016）23—3790—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.003

2016-06-14)

廣東省深圳市福田區(qū)公益性科研項(xiàng)目(編號(hào)：FTWS2014010)

謝茂云。E-mail：xiemaoyun@126.com