許可，李亮，林英姿

（海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南 ?？?571101）

FoxO3a對膠質瘤細胞株T98G和A172侵襲能力的影響

許可，李亮，林英姿

（海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南 ?？?571101）

目的 探討叉形框蛋白3a(FoxO3a)對膠質瘤細胞系T98G、A172細胞侵襲能力的影響。方法將FoxO3a的RNAi干擾序列嵌入慢病毒載體pHY-LV-KD1.1產(chǎn)生重組病毒載體pHY-FoxO3a-KD；FoxO3a DNA序列克隆入慢病毒表達載體PHY-LV-OE1.6。通過Trans-Lentiviral Packaging System和Vira Power Lentiviral Expression System(Invitrogen)對重組載體進行病毒包裝。重組后的慢病毒感染T98G、A172細胞，檢測相應細胞株侵襲能力的改變，并通過Western blot檢測膠質瘤侵襲相關的靶基因表達水平的變化。結果在T98G細胞中敲低FoxO3a后，腫瘤細胞侵襲能力下降并且侵襲相關基因MMP9表達水平下調；相反A172細胞中過表達FoxO3a腫瘤細胞侵襲能力增強。結論FoxO3a可以影響T98G、A172細胞的侵襲能力。

膠質瘤；T98G；A172；叉形框蛋白3a；基質金屬蛋白酶9；細胞侵襲

腦膠質瘤是起源于神經(jīng)外胚層的腫瘤，是顱內最常見的惡性腫瘤，年發(fā)病率為5/100 000[1]。目前治療方法是以手術治療為主聯(lián)合放射及化學治療等綜合治療方案。然而患者的預后并沒有得到明顯改善，平均存活時間只有12～15個月。在老年人群中，生存期不足一年[4]。叉形框蛋白3a(FoxO3a)蛋白是FoxO家族重要的成員，它在許多癌癥的病理過程中起著重要作用。盡管大多數(shù)報道認為FoxO3a是抑癌因子[3]，近來的研究表明FoxO3a在某些癌細胞中可以促進癌細胞侵襲[4]，但在膠質瘤細胞系T98G、A172中未見關于FoxO3a的報道。本文旨在探討FoxO3a對膠質瘤細胞T98G、A172侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系和細胞培養(yǎng) T98G、A172細胞系從中國科學院細胞庫購得(上海，中國)，人正常星形膠質細胞從美國標準菌庫(Manassas，VA，USA)購得。該細胞在37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)基選用Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM；Gibco，Paisley，UK)添加10%胎牛血清(FBS)以及100 μg/mL鏈霉素和1 U/mL青霉素。

1.2 慢病毒載體的構建與感染 通過BLOCK-iT RNAi designer(Invitrogen)設計針對FoxO3a干擾序列：FoxO3a-knockdown 3'-nockdown NAi designer'，并將合成后的序列克隆進pHY-LV-KD1.1表達載體(本實驗室保存)產(chǎn)生重組載體pHY-FoxO3a-KD。同時，設計一條無關序列克隆入pHY-LV-KD1.1載體作為陰性對照(NC)。人全長的FoxO3a cDNA從Open Biosystems購得。通過FoxO3a表達引物，正向：5'-ATGGCAGAGGCACCGGCTT-3'，反向：5'-GCCTGGCACCCAGCTC TGAG-3'進行擴增。通過XhoI/BamHⅠ酶切，膠回收純化處理后，克隆到PHY-LV-OE1.6(本實驗室保存)重組載體用于表達FoxO3a，命名為pHY-FoxO3a-OE；空載體作為陰性對照。通過Trans-Lentiviral Packaging System和Vira Power Lentiviral Expression System(In-vitrogen)包裝病毒顆粒，并感染相應細胞株。

1.3 細胞侵襲實驗 2×104穩(wěn)定株細胞24孔帶有8 μm孔徑的聚碳酸酯膜并包被30 μg Matrigel(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)的Boyden小室(Corning Costar，Cambridge，MA，USA)。細胞置于上室并用200 μL無血清培養(yǎng)基進行孵育。在下室加入20%FBS作為趨化因子。孵育36 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行3次清洗。上室中未發(fā)生侵襲的細胞用棉簽擦去。發(fā)生侵襲的細胞用多聚甲醛固定15 min。風干后，用0.1%的結晶紫染色15 min。用數(shù)碼相機拍照記錄。

1.4 免疫印跡法 提取出總蛋白進行SDS-Page電泳，然后通過濕轉膜法轉移至硝化纖維膜上，用相應的一抗過夜4℃孵育。一抗孵育使用抗體MMP9和MMP2(Santa Cruz)。

1.5 統(tǒng)計學方法 圖表上顯示的數(shù)據(jù)為三次獨立重復標準方差的平均值(±s)，組內差異通過ANOVA分析，兩組間的比較通過the Student's t-test完成。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。以上統(tǒng)計分析均通過GraphPad Prism6.0軟件分析完成。

2 結 果

2.1 FoxO3a對T98G、A172細胞侵襲的影響 筆者已檢測FoxO3a在膠質瘤細胞系T98G、U251、A172和T98G以及人正常星形膠質細胞中的表達。相對于其他細胞系，T98G細胞高表達FoxO3a而A172細胞低表達FoxO3a。因此，本組通過在T98G細胞中敲低FoxO3a，同時在A172細胞中過表達FoxO3a，探究該基因對膠質瘤細胞侵襲能力的影響。如圖1所示，通過Transwell試劑盒我們檢測了陰性對照組(NC)和FoxO3a敲低組之間T98G細胞侵襲能力的差異(各組內平行重復通過ANOVA分析。NC組P=0.413；FoxO3a敲低組P=0.570。結果表明在病毒FoxO3a-KD感染腫瘤細胞48 h后，與對照組比較，敲低組T98G的侵襲能力顯著下降(采用Student's t-test分析t=6.154，P=0.0003) (圖1)與這一結果基本一致的是，過表達FoxO3a的A172細胞的侵襲能力顯著增強(t=13.37，P＜0.0001)，見圖1。

圖1 FoxO3a對膠質瘤細胞侵襲的影響

2.2 FoxO3a對MMP9蛋白表達的影響 在膠質瘤中與侵襲密切相關的主要是金屬蛋白酶家族成員matrix-metalloproteinases(MMPs)的MMP9和MMP2[4]。通過Western blot技術試圖探究FoxO3a影響T98G侵襲的同時是否也影響了這兩個關鍵蛋白的表達。圖2表明敲低FoxO3a主要影響MMP9的表達而對MMP2的表達影響不顯著。

圖2 FoxO3a對MMP9蛋白表達的影響

3 討 論

盡管之前的研究認為FoxO3a是腫瘤抑制因子，近來的報道表明FoxO3a可促進腫瘤細胞的侵襲。乳腺浸潤性導管癌中，F(xiàn)oxO3a與淋巴結侵襲和預后差相關[5]。結腸癌中過表達FoxO3a可引起癌細胞侵襲能力的增強并發(fā)生轉移[6]。這些研究提示：FoxO3a在某些癌細胞中可能表現(xiàn)為另一種功能特性——促癌作用。有報道稱FoxO3a促使膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)增殖和自我更新[7]。然而關于是否FoxO3a促進膠質瘤細胞的侵襲未有報道。我們的結果表明在T98G、A172細胞中FoxO3a促進腫瘤細胞的侵襲。

惡性膠質瘤預后差，其中一個重要原因是膠質瘤細胞會侵襲到周邊正常組織內，這使得手術治療和放射性治療難以將這些腫瘤細胞徹底清除。侵襲的發(fā)生主要是由MMPs降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)導致。許多報道已經(jīng)證實MMP2和MMP9的表達上調易引起腫瘤細胞侵襲。通過檢測MMPs蛋白水平的表達筆者發(fā)現(xiàn)FoxO3a可以顯著影響MMP9的蛋白表達，這提示FoxO3a可能是通過MMP9影響T98G、A172膠質瘤細胞的侵襲。我們的研究可能為未來的靶向藥物治療膠質瘤提供新思路和新理論依據(jù)。

[1]Gavin MM,Nicholas P,Sally M,et al.PhaseⅡstudy of thalidomide in the treatment of recurrent glioblastoma multiforme[J].Journal of Neurooncology,2001,54(1):31-38.

[2]James JV,Annick D,James EH,et al.PhaseⅡtrial of bevacizumab and irinotecan in recurrent malignant glioma[J].Clinical Cancer Research,2007,13(4):1253-1259.

[3]Richard SN,Polla H.FoxO3a and disease progression[J].World J Biol Chem,2014,5(3):346-354.

[4]Ivy P,Richard CC,Kounosuke W,et al.Mechanisms regulating glioma invasion[J].Cancer Letters,2015,362(1):1-7.

[5]Jie C,Ana RG,Lara JM,et al.Constitutively nuclear FOXO3a localization predicts poor survival and promotes Akt phosphorylation in breast cancer[J].PLoS One,2010,5(8):e12293.

[6]Stephan PT,Paloma OM,Isabel P,et al.[beta]-catenin confers resistance to PI3K and AKT inhibitors and subverts FOXO3a to promote metastasis in colon cancer[J].Nature Medicine,2012,18(6): 892-901.

[7]Satoru O,Oltea S,Takatsune S,et al.IGF1 receptor signaling regulates adaptive radioprotection in glioma stem cells[J].Stem Cells, 2013,31(4):627-640.

Effect of FoxO3a on the invasion ability of human glioma cell line T98G and A172.

XU Ke,LI Liang,LIN Ying-zi. School of Tropical Medicine and Laboratory,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of forkhead box protein O3A(FoxO3a)on the invasion ability of human glioma cell line T98G and A172.MethodsFoxO3a RNAi sequence was inserted into pHY-LV-KD1.1(a lentivirus interference vector)to generate a recombinant expressing specific RNAi against FoxO3a.FoxO3a cDNA sequence was cloned into PHY-LV-OE1.6(a lentivirus expression vector).The recombinants were packaged into lentivirus particles by Trans-Lentiviral Packaging System and Vira Power Lentiviral Expression System(Invitrogen).Following infection of T98G and A172 cells by the lentiviruses,we evaluated the cell invasion by Transwell assay as well as the protein levels of glioma invasion related target genes by Western blot.ResultsAfter knocking down FoxO3a in T98G cells, the invasion ability of tumor cells decreased and the matrix metallo proteinase-9(MMP9)expression of invasion related genes was down regulated.By contrast,overexpression ofA172 in FoxO3a cells enhanced invasion ability of tumor cells.ConclusionFoxO3a can affect the invasion ability of T98G andA172 cells.

Glioma;T98G;A172;Forkhead box protein O3A(FoxO3a);Matrix metallo proteinase-9(MMP9); Cell invasion

R739.4

A

1003—6350（2016）23—3788—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.23.002

2016-04-26)

海南省自然科學基金（編號：20158310）

林英姿。E-mail：Alan-dd-shore@hotmail.com