張美，張叢蘭，楊芳，*

(1．武漢工程大學(xué)綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室/化工與制藥學(xué)院，湖北武漢 430073; 2．湖北大學(xué)知行學(xué)院，湖北武漢 430011)

不同方法對板栗仁多糖提取效果的比較

張美1，張叢蘭2，楊芳1，*

(1．武漢工程大學(xué)綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室/化工與制藥學(xué)院，湖北武漢 430073; 2．湖北大學(xué)知行學(xué)院，湖北武漢 430011)

以板栗仁為原料，分別采用水提取法、酶輔助法、微波輔助法提取板栗仁多糖。在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交設(shè)計，分別研究3種方法對板栗仁多糖的提取得率。結(jié)果表明，微波輔助法的提取得率最高，為9．34%;其次是酶輔助法，為7．36%;水提法最低，為6．24%。采用SPSS軟件分析，結(jié)果顯示，3種方法提取得率之間存在顯著差異。

板栗仁;多糖;水提取法;酶輔助法;微波輔助法

板栗(Castaneamollissima Blume)屬殼斗科(Fagaccac)栗屬堅果類植物，又名栗、栗子、大栗等，是我國的特產(chǎn)植物，世界上重要的干果之一［1］。板栗的營養(yǎng)成分及其含量比例，因種類、品種及產(chǎn)地不同而有所差異。一般而言，板栗仁營養(yǎng)成分以糖類為主，其中淀粉占干物質(zhì)的45%～65%左右，可溶性糖20%～27%，還原糖5%～18%，蔗糖3%～27%;富含蛋白質(zhì)(5．7%～10．7%)、脂肪(2%～7．4%)，并含有多種維生素、無機鹽、不飽和脂肪酸和黃酮類物質(zhì)等［2］。板栗多糖為白色粉末，較易溶于熱水，難溶于冷水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇以及異丙醇等有機溶劑中。板栗多糖由葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖所組成，紅外光譜顯示，其多糖以β-1，4糖苷鍵連接［3］。近年來，大量藥理及臨床研究表明，多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗氧化功能［4］，還能激活免疫受體，提高機體的免疫功能，具有毒副作用小以及安全性高等優(yōu)點。板栗碳水化合物含量較高，其多糖亦具有良好的抗氧化活性，可以開發(fā)成一個新的膳食補充劑和功能性食品［5］。目前，板栗多糖提取方法主要有水提取法、超聲波輔助水浸提法［6］、酶水解法［7］以及加壓溶劑萃取法［8］。但是，在多糖生產(chǎn)中，如何在提高提取率的同時，降低生產(chǎn)能耗和成本，并保持其生理活性，是該工藝中的難點。

本研究采用水提取法、酶輔助法以及微波輔助法提取板栗仁多糖，采用正交實驗設(shè)計探索板栗仁多糖提取的最佳工藝組合，為進一步研究板栗多糖的生物活性提供了基礎(chǔ)，為板栗的精深加工利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗為市售湖北荊山板栗。α-淀粉酶(1×104U/g)和β-淀粉酶(1×104U/g)購于山東隆科特酶制劑有限公司。三氯甲烷、正丁醇、乙醇、乙醚、濃硫酸、蒽酮均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-80型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;JY2003型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;MAS-ⅡPlus型微波萃取儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;TDL-40B型臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;SH2-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司;WGL-30B型電熱風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司;722型分光光度計，上海天普分析儀器制造廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

參考文獻［9］的方法對樣品預(yù)處理。板栗經(jīng)脫殼、清洗、干燥、粉碎后，過40目篩。按m(粉)∶V(乙醚)=1 g∶3 mL的比例，采用無水乙醚索氏抽提6～8 h，取粉末，去脂肪。然后采用無水乙醇為溶劑，按照1 g/mL的質(zhì)量濃度浸泡提取4 h，以去除蛋白質(zhì)。所得粉末樣品經(jīng)活性炭粉脫色，干燥后得到板栗仁粉，密封冷凍于冰箱中備用。

1.3.2 板栗仁多糖提取

1.3．2.1 水提取法

稱取10．0 g上述1.3.1中處理的板栗仁粉，以水為溶劑，按設(shè)定條件(提取溫度、提取時間以及料液比)進行多糖提取。將提取后的混合液進行離心(轉(zhuǎn)速為3 800 r/min，時間為10 min)，除去不溶性物質(zhì)。將上層提取液減壓濃縮至20～30 mL左右，然后將V(CHCl3)∶V(正丁醇)混合液等體積加入濃縮液，充分振蕩使兩相混勻，靜置后分層，除去中間層變性蛋白質(zhì)。收集上清液，向上清液加入乙醇的終濃度為φ(乙醇)=80%，邊加邊攪拌，得灰色絮狀沉淀，靜置過夜，傾出上清液，即得板栗多糖溶液。將上清液進行適當(dāng)稀釋，測定多糖含量。

1.3．2.2 酶輔助提取法

稱取10．0 g上述1.3.1中處理的板栗仁粉，以水為溶劑，加入α-淀粉酶和β-淀粉酶分別為板栗仁粉質(zhì)量的0．2%，按設(shè)定條件(提取溫度、提取時間以及料液比)，參考1.3.2.1的方法，進行多糖提取和除雜。

1.3．2.3 微波輔助提取法

稱取10．0 g上述1.3.1中處理的板栗仁粉，以水為溶劑，先進行微波處理，在繼續(xù)提取一定時間，按設(shè)定條件(提取時間、微波處理時間和微波處理功率)，參考1.3.2.1的方法，進行多糖提取和除雜。

1.3.3 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的計算方法

配制不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，加入0．5 mL新配置的蒽酮乙酸乙酯試劑(w=0．2%)和5 mL濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，準(zhǔn)確保溫10 min，取出后自然冷卻至室溫，以空白溶液作參比，在620 nm處測定吸光值(A)，并以吸光度值(A)對葡萄糖質(zhì)量濃度(C)進行回歸分析，得回歸方程。

1.3.4 多糖含量測定和得率計算

取1.3.2中經(jīng)提純除雜后的樣品提取液1 mL于比色管中，加入0．5 mL新配置的蒽酮乙酸乙酯試劑(w=0．2%)和5 mL濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，準(zhǔn)確保溫10 min，取出后自然冷卻至室溫，以空白溶液作參比，在620 nm處測定吸光值(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。根據(jù)式(1)計算多糖的得率。

式(1)中，C為糖質(zhì)量濃度，mg/mL;X為稀釋倍數(shù);M為提取所用板栗仁粉的質(zhì)量，g。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用Sigmaplot 11．0軟件繪圖，采用SPSS statistics 20．0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程

建立的多糖測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A= 0．005C;R2=0．996 5。

2.2 水提取法的得率分析

分別考察提取溫度、提取時間和料液比對水提取法提取效果的影響，再根據(jù)單因素實驗的結(jié)果進行L9(33)正交試驗，確定水提取法最佳提取工藝。

2.2.1 提取溫度對板栗仁多糖得率的影響

參照1.3.2.1方法進行多糖提取，在浸提時間(60 min)和1∶20 g/mL料液比(即板栗仁粉質(zhì)量與提取溶劑體積的比例)不變的條件下，分別研究提取溫度為50，60，70，80，90℃以及100℃時的多糖得率，結(jié)果如圖1。

由圖1可看出，在提取時間為60 min，料液比為1∶15的條件下，當(dāng)提取溫度在50～80℃時，隨著提取溫度的升高，板栗仁多糖的得率逐漸提高，但超過80℃后，板栗仁多糖得率開始緩慢下降。高溫會使板栗仁多糖分解從而降低粗多糖含量［10］，從圖1可以看出，提取最佳溫度為80℃。

圖1 水提取法中提取溫度對板栗仁多糖得率的影響Fig．1Effect of temperature on yield of chestnut fruit polysaccharide by water extraction method

2.2.2 提取時間對板栗仁多糖得率的影響

在浸提溫度(80℃)和料液比(1∶20 g/mL)不變的條件下，分別研究提取時間為30，60，90，120，150 min以及180 min時的多糖得率，結(jié)果如圖2。

圖2 水提取法中提取時間對板栗仁多糖得率的影響Fig．2Effect of time on yield of chestnut fruit polysaccharide by water extraction method

由圖2可看出，當(dāng)提取時間在30～180 min時，隨著提取時間的延長，板栗仁多糖的得率逐漸提高，但超過120 min后，板栗仁多糖得率開始緩慢降低。其原因可能是由于浸提時間過長會使粗多糖發(fā)生分解，從而使得率降低［10］。因此，綜合考慮成本和設(shè)備使用情況，提取時間選擇120 min。

2.2.3 料液比對板栗仁多糖得率的影響

在浸提溫度(80℃)和浸提時間(60 min)不變的條件下，分別研究料液比為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40 g/mL時的多糖得率，結(jié)果如圖3。

由圖3可看出，料液比在1∶15～1∶30 g/mL之間時，對得率影響較大，當(dāng)達到一定料液比以后影響逐漸減小，這是因為加水量越大，達到提取平衡以后提取液中的粗多糖濃度越低，最后殘留在板栗粗多糖提取后的殘渣中的粗多糖越少，即得率就越高。但也應(yīng)看到隨著料液比的加大，粗多糖得率的增加會逐漸減小，而較大的料液比會加大后續(xù)粗多糖分離的負(fù)荷，這是實際生產(chǎn)中需考慮的因素。本實驗結(jié)果顯示，在提取時間為60 min，溫度為80℃的條件下，當(dāng)料液比為1∶30時，板栗仁多糖的得率最高，故選擇料液比為1∶30 g/mL進行正交試驗。

圖3 水提取法中料液比對板栗仁多糖得率的影響Fig．3Effect of material-liquid ratio on yield of chestnut fruit polysaccharide by in water extraction

2.2.4 水提取法正交試驗結(jié)果

以提取溫度、提取時間和料液比為影響因素，根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果，選用L9(33)正交設(shè)計表進行正交試驗，以多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)選較佳提取工藝。正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 水提取法正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab．1Orthogonal design and results for yield of chestnut fruits polysaccharides by water extraction method

由表1可知，在水提法提取板栗仁多糖的實驗中，各因素對多糖得率的影響依次為∶提取溫度＞料液比＞提取時間。其實驗的較優(yōu)組合為A3B3C2，即提取溫度90℃，提取時間150 min，提取料液比1∶30 g/mL，在此條件下，最高得率可以達到6．24%。

2.3 酶輔助提取法的得率分析

分別考察提取溫度、提取時間和料液比對酶輔助提取法提取效果的影響，再根據(jù)單因素實驗的結(jié)果進行L9(33)正交試驗，確定酶輔助提取法最佳提取工藝。

2.3.1 提取時間對板栗仁多糖得率的影響

參照1.3.2.2方法進行多糖提取，α-淀粉酶和β-淀粉酶的添加量分別為0．2%(相對于板栗仁的質(zhì)量比)，在提取溫度(45℃)和料液比(1∶15 g/mL)不變的條件下，分別研究提取時間為180，210，240，270，300 min時的多糖得率，結(jié)果如圖4。

圖4 酶輔助提取法中提取時間對板栗仁多糖得率的影響Fig．4Effect of time on yield of chestnut fruit polysaccharide by enzyme-assistant extraction method

由圖4可看出，在提取溫度為45℃，料液比為1∶15 g/mL的條件下，當(dāng)提取時間在180～240 min時，隨著提取溫度的升高，板栗仁多糖的得率逐漸提高，但超過240 min后，板栗仁多糖得率開始緩慢下降。從圖4可以看出，提取時間選擇240 min可以達到最高的得率。

2.3.2 提取溫度對板栗仁多糖得率的影響

參照1．3．2．2方法進行多糖提取，分別研究提取溫度為35，40，45，50，55℃時的多糖得率，結(jié)果如圖5。

由圖5可看出，在提取時間為240 min，料液比為1∶15 g/mL的條件下，當(dāng)提取溫度在35～45℃時，隨著提取溫度的升高，板栗仁多糖的得率逐漸提高，但超過45℃后，板栗仁多糖得率開始緩慢下降。高溫會使體系中的淀粉酶失活從而降低粗多糖含量［11］，從圖5可以看出，提取溫度選擇45℃可以達到最高的得率。

2.3.3 料液比對板栗仁多糖得率的影響

參照1．3．2．2方法進行多糖提取，分別研究料液比為1∶9，1∶12，1∶15，1∶18，1∶21 g/mL時的多糖得率，結(jié)果如圖6。

圖5 酶輔助提取法中提取溫度對板栗仁多糖得率的影響Fig．5Effect of temperature on yield of chestnut fruit polysaccharide by enzyme-assistant extraction method

圖6 酶輔助提取法中料液比對板栗仁多糖得率的影響Fig．6Effect of material-liquid ratio on yield of chestnut fruit polysaccharide by enzyme-assisted extraction

由圖6可看出，在采用酶輔助法提取板栗仁多糖時，α-淀粉酶和β-淀粉酶的添加量分別為ω(淀粉酶)=0．2%(相對于板栗仁的質(zhì)量比)，在提取時間為240 min，溫度為45℃的條件下，當(dāng)料液比為1∶15 g/mL時，板栗仁多糖的得率最高，故選擇料液比為1∶15 g/mL做正交試驗。

2.3.4 酶輔助法正交試驗結(jié)果

以提取溫度、提取時間和料液比為影響因素，根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果，選用L9(33)正交設(shè)計表進行正交試驗，以多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)選較佳酶輔助提取工藝。正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

由表2可知，在酶輔助法提取板栗仁多糖的實驗中，各因素對多糖得率的影響依次為:提取時間＞料液比＞提取溫度。其實驗的較優(yōu)組合為A2B2C3，即提取溫度45℃，提取時間240 min，提取料液比1∶18 g/mL，在此條件下，得率可以達到7．36%。

2.4 微波輔助法的得率分析

分別考察提取時間、微波處理時間和微波處理功率對微波輔助提取法提取效果的影響，再根據(jù)單因素實驗的結(jié)果進行L9(33)正交試驗，確定微波輔助提取法的最佳提取工藝。2.4.1提取時間對板栗仁多糖得率的影響

表2 酶輔助提取法正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab．2Orthogonal design and results for yield of chestnut fruit polysaccharides by enzyme-assisted method

參照1.3.2.3方法進行多糖提取，在微波處理時間(4 min)和微波處理功率3檔(400 W)不變的條件下，分別研究提取時間為80，100，120，140，160 min時的多糖得率，結(jié)果如圖7。

圖7 提取時間對板栗仁多糖得率的影響Fig．7Effect of extraction time on yield of chestnut fruit polysaccharide by microwave-assistant extraction method

由圖7可以看出，提取時間在80～100 min時，板栗仁多糖得率隨時間延長而增大，這是因為隨著提取時間延長，浸提液中的粗多糖與板栗中的粗多糖濃度差逐漸減小，達到一定提取時間(100 min)后，浸提液中的粗多糖含量與板栗原料中的粗多糖含量達到平衡，得率達到最高(6．94%)。微波提取時間在100～160 min時，板栗仁多糖得率隨時間延長而降低，這可能是因為浸提時間過長會使多糖發(fā)生水解、膠凝作用以及焦糖化反應(yīng)，從而使板栗多糖得率降低。另外，浸提的實質(zhì)是固相傳遞至液相的傳質(zhì)過程，根據(jù)擴散理論，就是溶質(zhì)從高濃度區(qū)向低濃度區(qū)滲透的過程，這可能是由于一定時間的浸提后，物料中溶質(zhì)與溶液環(huán)境中的溶質(zhì)達到相對平衡，趨于某一常數(shù)，從而使浸提率降低［12］。

2.4.2 微波處理時間對板栗仁多糖得率的影響

分別研究微波處理時間為2，3，4，5 min以及6 min時的多糖得率，結(jié)果如圖8。

圖8 微波處理時間對板栗仁多糖得率的影響Fig．8Effect of microwave processing time on yield of chestnut fruit polysaccharide by microwave-assistant extraction method

由圖8可以看出，微波處理時間在2～5 min時，板栗仁多糖得率隨時間延長而增大，這是因為隨著微波處理時間延長，板栗仁多糖得率逐漸提高，當(dāng)微波處理時間為5 min時，得率達到最大值(8．13%)。一方面，微波同時提高了顆粒內(nèi)部的溫度和壓力，擴散速度加快;另一方面，細(xì)胞壁受到破壞而孔徑增大，利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出［13］。微波提取時間在5～6 min時，板栗仁多糖得率隨時間延長而降低，這可能是由于微波作用時間過長，降低了某些反應(yīng)的活化能，使多糖分子之間、多糖分子與其他分子之間形成新的作用力，增加分子之間的碰撞機會，阻止多糖分子溶出，也可能是由于蛋白質(zhì)變性沉淀后包裹在板栗顆粒表面，導(dǎo)致多糖得率降低。此外，隨著微波處理時間增加，多糖的水解，淀粉糊化等也會加劇，從而使多糖得率降低。

2.4.3 微波處理功率對板栗多糖得率的影響

參照1.3.2.3方法分別研究了5個不同檔位的微波處理功率(功率1為100 W;功率2為200 W;功率3為400 W;功率4為600 W;功率5為800 W)對多糖得率的影響，結(jié)果如圖9。

由圖9可以看出，隨著微波處理功率提高，板栗仁多糖得率先增加，達到最大值(8．54%)后，又逐漸減小。這是因為在微波交變電磁場的作用下，極性物質(zhì)(包括水在內(nèi))引起強烈的極性振蕩，可導(dǎo)致電容性細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)帶擊穿破裂，或者細(xì)胞分子間氫鍵松弛等破壞，使得組成生物體的最基本單元細(xì)胞的生命化學(xué)活動過程中所必須具備的物質(zhì)、能量交換的正常條件和環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，這樣有利于物質(zhì)的迅速浸出和擴散［14］。此外，微波處理過程中會使溶液溫度升高，從而促進多糖溶出。但是，在功率4檔(600 W)到5檔(800 W)時，隨著微波功率增加，板栗仁多糖得率逐漸降低，這可能是由于微波功率過高，使板栗粗多糖部分分解。

圖9 微波處理功率對板栗仁多糖得率的影響Fig．9Effect of microwave processing power on yield of chestnut fruit polysaccharide by microwave-assistant extraction method

2.4.4 微波輔助法正交實驗結(jié)果

以提取時間、微波處理時間和微波處理功率為影響因素，根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果，選用L9(33)正交設(shè)計表進行正交試驗，以多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)選較佳微波輔助提取工藝。正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

由表3可知，在微波輔助法提取板栗仁多糖的實驗中，各因素對多糖得率的影響由大到小依次為:微波處理功率、提取時間、微波處理時間。其實驗的較優(yōu)組合為A1B2C2，即提取時間80 min，微波處理時間為5 min，微波處理功率為600 W，在此條件下，得率可以達到9．34%。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，3種提取方法在正交試驗優(yōu)化工藝后，得率均有提高，其中，微波提取法得率高達9．34%，酶輔助提取法的得率為7．36%，而水提取法的得率為6．24%。水提取法利用多糖易溶于水的原理進行提取，得率較低。酶輔助提取法利用淀粉酶分解板栗淀粉，在一定程度上可以提高板栗仁中非淀粉多糖的提取率，但是，會產(chǎn)生提取成本提高和酶與產(chǎn)物分離等問題。微波輔助法提取板栗多糖的得率顯著高于酶輔助提取法和水提法，最佳工藝為提取時間80 min，微波處理時間5 min，微波處理功率為600 W。通過3種板栗多糖提取方法的比較，微波提取法效率高，升溫快速均勻，能大大縮短萃取時間。此外，微波射線的穿透性極好，在接近環(huán)境溫度下提取所需的有效成分，對熱敏性成分的浸提極為有利，可以更好地保護板栗仁多糖的生物活性。在工業(yè)化生產(chǎn)中，選擇非淀粉多糖含量高的板栗品種，結(jié)合微波高效提取技術(shù)，可為板栗精深加工提供一個新的途徑。

表3 微波輔助提取法正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab．3Orthogonal design and results for yield of chestnut fruits polysaccharides by microwave-assisted method

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LIN Y，CAO S Y，CAO D X，et al．Progress of research on extraction of polysaccharide from kelp［J］．Fisheries Science and Technology Information，2008，35 (4):168-170．

Comparison of Different Extraction Methods About Polysaccharides of Chestnut Fruit

ZHANG Mei1，ZHANG Conglan2，YANG Fang1，*
(1．Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education/School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073，China; 2．Zhixing College，Hubei University，Wuhan 430011，China)

Chestnut polysaccharide was extracted by water extraction method，enzyme-assisted method，and microwave-assisted method．According to single factor experiments，the orthogonal design was used to optimize the polysaccharide extraction process．The results showed that microwave-assisted extraction has the highest yield(9．34%)，followed by enzyme-assisted method(7．36%)and water extraction method(6．24%)．Analysis results by SPSS software showed that the extraction yields of the three methods had significant differences．

chestnut fruit;polysaccharide;water extraction method;enzyme-assisted method;microwave-assisted method

李寧)

TS255．1

A

10．3969/j．issn．2095-6002．2016．06． 010

2095-6002(2016)06-0053- 07

2015-11- 09

湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計劃優(yōu)秀中青年人才項目(Q20121511)。

張美，女，講師，碩士，主要從事食品加工方面的研究;

*楊芳，女，副教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工方面的研究。

。

張美，張叢蘭，楊芳．不同方法對板栗仁多糖提取效果的比較［J］．食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2016，34(6):53-59．

ZHANG Mei，ZHANG Conglan，YANG Fang．Comparison of different extraction methods about polysaccharides of chestnut fruit［J］．Journal of Food Science and Technology，2016，34(6):53-59．