高航，單雪玉，高延芬，徐虹，*

(1．北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心/北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048;2．深圳市航天食品分析測試中心有限公司，廣東深圳 518040)

蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

高航1，單雪玉1，高延芬2，徐虹1，*

(1．北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心/北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048;2．深圳市航天食品分析測試中心有限公司，廣東深圳 518040)

采用分光光度法測定了不同條件下蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響，在單因素實驗基礎(chǔ)上運用L9(34)正交法得到蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的優(yōu)化條件。研究結(jié)果顯示，在pH值為6．8，質(zhì)量濃度為1．50 g/L，反應(yīng)時間為20 min時，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率最高，可達67．99%±1．79%。蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為反競爭性抑制，抑制常數(shù)為0．24 g/L。

蓮子紅衣多酚;α-葡萄糖苷酶;活性抑制;抑制類型

研究發(fā)現(xiàn)，降低餐后血糖可有效控制糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展［1］。α-葡萄糖苷酶是小腸絨毛上皮細胞刷狀緣膜上存在的寡糖水解酶，可催化α-1，4糖苷鍵水解。α-葡萄糖苷酶可將碳水化合物分解為葡萄糖，因此抑制α-葡萄糖苷酶活性，并可延緩及阻礙葡萄糖的生成及吸收，降低餐后血糖峰值，達到控制及預(yù)防糖尿病的效果［2］。眾多研究已表明，植物多酚對α-葡萄糖苷酶具有很強的抑制作用，并且具有來源廣泛、毒副作用小等特點。目前，植物源α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選已經(jīng)成為天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的熱點［3-5］。

蓮子紅衣為蓮子殼與蓮子果實中間包裹的一層紅褐色種皮，《本草綱目》和《中華藥典》記載其味苦而澀、性涼無毒，入心、脾二經(jīng)，且具有清熱利濕、收斂，治濕熱瀉痢等作用［6］。在蓮子加工過程中，這層紅衣一般通過機械打磨去除，我國每年在白蓮加工過程中會產(chǎn)生約1萬t蓮子紅衣粉。目前這些加工副產(chǎn)物尚無有效利用方式，且因其味澀甚至不能作為牲畜飼料，因而常被大量廢棄并造成環(huán)境污染。本課題組前期研究已經(jīng)對蓮子紅衣中的活性成分進行了初步探索，其中活性多酚類物質(zhì)含量較高，且具有顯著的抗氧化和抗蘋果褐變活性［7-8］。為更好地開發(fā)利用蓮子工業(yè)加工中的副產(chǎn)物，本研究從蓮子紅衣粉中提取獲得其中的多酚物質(zhì)，探討其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。希望本研究成果能夠為糖尿病人群功能食品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子紅衣粉，三湘貿(mào)易公司;α-葡萄糖苷酶(BR)，上海源葉生物科技有限公司;4-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(pNPG)、4-硝基苯酚(PNP)，美國Sigma公司;Na2CO3、K2HPO4、KH2PO4、Na2CO3(均為化學(xué)純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;沒食子酸(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;福林酚(化學(xué)純)，北京普博欣生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003C型電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司;FE20型實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-501型超級恒溫水浴(數(shù)顯)，常州國華電器有限公司;DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精密實驗設(shè)備有限公司; 22PCO2435型可見分光光度計、SpectrumLab 53型紫外-可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司;QL -901 VORTEX型漩渦混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;MODULYOD-230型真空冷凍干燥機，美國熱電公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蓮子紅衣多酚的提取

蓮子紅衣(日照曬干，含水量為8．5%)粉碎過篩至80目，按料(g)液(L)比1∶1．8加入體積分數(shù)為60%的乙醇，在49℃下300 W微波提取9．5 min，提取液10000 r/min離心10 min，上清液旋蒸后真空冷凍干燥，4℃保存，備用。

1.3.2 蓮子紅衣多酚的質(zhì)譜分析

采用Thermo的TSQ質(zhì)譜定量分析蓮子紅衣多酚可能含有的多酚類物質(zhì)。通過與蘆丁、表兒茶素等8種標準品進行比對，根據(jù)出峰情況來確定蓮子紅衣多酚中各種標品的含量。色譜柱，C18(30 mm ×3．0 mm);進樣量7 μL，流速200 μL/min;流動相A，0．1%甲酸-氰化氫;流動相B，0．1%甲酸-水，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫蓮子紅衣多酚成分的條件Tab．1Gradient elution for determination of compounds

1.3.3 蓮子紅衣多酚提取物含量的測定

1)標準曲線的建立［9］。準確稱取沒食子酸0．10 g，蒸餾水溶解并定容至100 mL，分別移取0，20，40，60，80，100，120 μL到7個具塞試管中并用蒸餾水定容至1 mL，即得到不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標準溶液;分別加入2 mL質(zhì)量濃度為20 g/L的 Na2CO3，2 min后，將1 mL的福林酚試劑(按體積比1∶1與水稀釋)加入到混合物中，反應(yīng)30 min后在750 nm波長處測定吸光度;以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

2)樣品測定。加入適當質(zhì)量濃度樣品，具體步驟同上，通過回歸方程得出等價沒食子酸含量。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶活力的測定［10］

α-葡萄糖苷酶活力單位定義:37℃，在pH值為6．8條件下，每分鐘水解底物釋放1．0 μmol對硝基苯酚規(guī)定為一個酶活力單位(U)。

蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率計算公式，見式(1)。

1.3.5 反應(yīng)時間對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響實驗

將α-葡萄糖苷酶溶液與600 μL蓮子紅衣多酚溶液混勻后在37℃預(yù)熱5 min，加入200 μL、pNPG啟動反應(yīng)，分別在10，15，20，25，30 min時終止反應(yīng)，測定不同時間剩余酶活力，計算抑制率。

1.3.6 蓮子紅衣多酚濃度對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響實驗

在pH值為6．8時，將α-葡萄糖苷酶溶液分別與質(zhì)量濃度為0．10，0．50，1．00，1．50，2．00 g/L的蓮子紅衣多酚溶液混勻，并在37℃預(yù)熱5 min，加入pNPG啟動反應(yīng)。20 min后終止反應(yīng)，測定加入不同濃度多酚溶液后的酶活力，并計算抑制率。

1.3.7 緩沖液pH值對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響實驗

以pH值為6．4，6．6，6．8，7．0，7．2的緩沖液為溶劑，分別配制1．0 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和1．0 mmol/L pNPG底物溶液。將1．0 U/mL α-葡萄糖苷酶600 μL與1．00 g/L蓮子紅衣多酚溶液600 μL混勻，于37℃水浴中預(yù)熱5 min，加入1．0 mmol/L pNPG 200 μL，20 min后終止反應(yīng)，測定不同pH值緩沖液條件下的酶活力，計算抑制率。

1.3.8 蓮子紅衣多酚抑制α-葡萄糖苷酶活力的條件優(yōu)化實驗

為了綜合考慮各因素對α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響，綜合單因素實驗結(jié)果，選擇反應(yīng)時間(A)、抑制劑質(zhì)量濃度(B)、pH值(C)三個因素，采用L9(34)正交試驗法對抑制α-葡萄糖苷酶活性的條件進行優(yōu)化，正交試驗因素水平，見表2。1.3.9抑制作用類型的測定

表2 正交試驗因素水平Tab．2Factors and levels of orthogonal experiments

將α-葡萄糖苷酶分別與質(zhì)量濃度為1．00，1．50，2．00 g/L的蓮子紅衣多酚混勻，預(yù)熱5 min后加入不同濃度的pNPG溶液反應(yīng)20 min，加入0．5 mol/L Na2CO31．0 mL。以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)1/［S］為橫坐標，反應(yīng)速度的倒數(shù)1/v為縱坐標，繪制蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶抑制作用的雙倒數(shù)圖，根據(jù)雙倒數(shù)方程計算其抑制常數(shù)Ki。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮子紅衣多酚中成分及含量分析

蓮子紅衣多酚組成和含量分析結(jié)果見表3。據(jù)表3可知，蓮子紅衣多酚中兒茶素的質(zhì)量分數(shù)最高，占28．05%，表兒茶素和沒食子酸次之，分別為23．24%和16．36%。根皮苷、蘆丁、阿魏酸、槲皮素和咖啡酸的含量都較少，且依次減少。根據(jù)標準曲線的制作方法，得回歸方程，見式(2)。

通過回歸方程得出每克蓮子紅衣提取物中多酚質(zhì)量為(237．91±11．28)mg。

表3 蓮子紅衣多酚組成和含量分析結(jié)果Tab．3Content analysis results of lotus red polyphenol %

2.2 反應(yīng)時間對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響

按照1.3.5方法，在酶與底物反應(yīng)時間分別為10，15，20，25，30 min時終止反應(yīng)，計算蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，變化趨勢如圖1。

圖1 反應(yīng)時間與α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的關(guān)系Fig．1Effect of different reaction time on activity of α-glucosidase

從圖1可以看出，在反應(yīng)時間小于20 min時，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制效果不佳，抑制率較低。隨著反應(yīng)時間的延長，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且在加入底物反應(yīng)20 min時，抑制率達到最大。

2.3 蓮子紅衣多酚質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響

按照1.3.6方法，將質(zhì)量濃度分別為0．10，0．50，1．00，1．50，2．00 g/L的蓮子紅衣多酚溶液加入到反應(yīng)體系當中，終止反應(yīng)后計算蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，結(jié)果見圖2。

圖2 蓮子紅衣多酚質(zhì)量濃度與α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的關(guān)系Fig．2Effect of lotus seed skin concentrations on activity of α-glucosidase

圖2顯示，蓮子紅衣多酚在較低濃度范圍內(nèi)即可達到較高的抑制效果。蓮子紅衣多酚質(zhì)量濃度為1．00 g/L時，抑制作用接近70%。然而并非多酚質(zhì)量濃度越大，抑制效果越好，當多酚質(zhì)量濃度在2．00 g/L時，抑制率迅速下降，很可能是多酚達到一定濃度后會改變酶的構(gòu)象。

2.4 緩沖液pH值對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響

按照1.3.7方法，在pH值為6．6，6．8，7．0，7．2的緩沖液體系中啟動反應(yīng)，計算蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，變化曲線見圖3。

圖3 緩沖液pH值與α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的關(guān)系Fig．3Effect of pH on activity of α-glucosidase

由圖3可見，在實驗范圍內(nèi)(pH值為7．0～7．8)，α-葡萄糖苷酶抑制率先隨pH值增加而迅速升高，隨后隨著pH值增加而逐漸下降。在pH值為6．8時，α-葡萄糖苷酶的抑制率達到最高。

2.5 蓮子紅衣多酚抑制α-葡萄糖苷酶活力的條件優(yōu)化

采用正交試驗法對蓮子紅衣多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性作用進行優(yōu)化，結(jié)果見表4。

表4 正交試驗結(jié)果Tab．4Results of orthogonal design

表4中，通過K值大小可得出各因素對抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響效果，從大到小順序為:反應(yīng)時間、pH值、抑制劑質(zhì)量濃度。綜合分析結(jié)果可知，抑制效果較佳時反應(yīng)條件為A2B3C2，即在pH值為6．8條件下，使用抑制劑質(zhì)量濃度為1．50 g/L，反應(yīng)時間為20 min時，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制率可達到最高。

2.6 驗證實驗結(jié)果分析

按照A2B2C3的條件進行驗證實驗，結(jié)果顯示，A2B2C3的抑制率為67．99%±1．70%。因此，最終確定優(yōu)化反應(yīng)條件為pH值6．8，抑制劑質(zhì)量濃度1．50 g/L，反應(yīng)時間為20 min。

2.7 抑制作用類型的確定

按照1.3.9方法，測定不同條件下的酶活力，采用雙倒數(shù)作圖法，求解抑制常數(shù)并確定抑制類型，結(jié)果見圖4。

圖4 蓮子紅衣多酚抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線Fig．4Lineweaver-Burk figure of polyphenols from lotus seed skin on α-glucosidase

從圖4可以看出，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用與其質(zhì)量濃度存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。隨著蓮子紅衣多酚質(zhì)量濃度的增大，其對α-葡萄糖苷酶抑制作用逐漸增強。α-葡萄糖苷酶動力學(xué)曲線vmax值變小，Km值也變小，而vmax/Km值不變。這表明了蓮子紅衣多酚是α-葡萄糖苷酶的反競爭性抑制劑，即抑制劑只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合，而不與游離酶結(jié)合。當蓮子紅衣多酚質(zhì)量濃度為1．00 g/L時，其對α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)Ki為0．24 g/L。

3 討論與結(jié)論

我國為產(chǎn)蓮大國，蓮子在加工過程中打磨出的大量紅衣粉，目前僅被作為廢棄物浪費，至今沒有得到很好應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，這些廢棄物中不乏豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分［8］，若能從中分離獲得有效的功能性成分并在保健食品中得以應(yīng)用，將會大大提高蓮子紅衣副產(chǎn)物的利用率，并有助于提升蓮子的綜合利用價值和經(jīng)濟價值，同時希望為新資源的開發(fā)利用提供更多的理論依據(jù)。

大量研究顯示，多種植物中所含的多酚類物質(zhì)具有α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用，從而延緩人體對食物中葡萄糖的吸收，降低餐后血糖。比較近年來多篇研究報道，可知不同植物源α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制作用差別很大，如石榴花多酚對體外α-葡萄糖苷酶的抑制率可達90．79%［11］，而溪黃草多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率為44．15%［12］。本研究結(jié)果顯示，蓮子紅衣多酚對體外α-葡萄糖苷酶的抑制率可達67．99%±1．79%，其抑制類型為反競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki為0．24 g/L。從目前研究來看，酚類提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型包括非競爭性抑制、競爭性抑制和反競爭性抑制，這可能與其主要抑制酶活性成分的組成與結(jié)構(gòu)以及與酶活性中心的結(jié)合部位和結(jié)合方式等的不同有關(guān)［13-14］。后期我們將進一步對蓮子紅衣多酚進行分級分離，以期更深入研究各多酚組分與α-葡萄糖苷酶之間的構(gòu)效關(guān)系。此外，我們還將進行動物實驗，從體內(nèi)到體外綜合評價蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制機制，發(fā)揮其輔助治療糖尿病的功效。

綜上所述，不良飲食是導(dǎo)致糖尿病的主要原因之一，如能有效控制體內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性，便可減少食物中糖類物質(zhì)的消化吸收，達到預(yù)防和治療糖尿病的效果。從本研究結(jié)果可知，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制效果顯著，且原料資源豐富、價格極其低廉，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

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Inhibitory Effect on α-Glucosidase Activity of Polyphenol from Red-skin of Lotus Seed

GAO Hang1，SHAN Xueyu1，GAO Yanfen2，XU Hong1，*
(1．Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives/Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China; 2．Shenzhen Space Food Analysis and Test Center Limited Company，Shenzhen 518040，China)

The aim of the research was to discuss the inhibitory effect of polyphenol from lotus seed redskin on α-glucosidase activity．It was designed to measure the α-glucosidase activity in different conditions using spectrophotometry．With the inhibitory effect on α-glucosidase activity as the index，the inhibitory conditions were optimized by the L9(34)orthogonal optimization method．The results revealed that the optimal inhibition rate was 67．99%±1．79%at pH 6．8，1．50 g/L of polyphenol concentration and 20 min of reaction time．In addition，polyphenol was an anti-competitive inhibition type of inhibitor on αglucosidase，and its inhibition constant was 0．24 g/L．

polyphenol from lotus seed red-skin;α-glucosidase;activity inhibition;inhibitor type

葉紅波)

TS201．2

A

10．3969/j．issn．2095-6002．2016．06． 007

2095-6002(2016)06-0036- 05

2016-03- 01

北京市自然科學(xué)基金資助項目(6162003);北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團隊建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計劃項目(IDHT20130506)。

高航，女，碩士研究生，研究方向為功能性食品;

*徐虹，女，副教授，博士，主要從事食品營養(yǎng)與安全方面的研究。

。

高航，單雪玉，高延芬，等．蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用［J］．食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2016，34(6):36-40．

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