張光銀，馬惠寧，李南南，王愛(ài)迪，張軍平

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 天津 300193）

補(bǔ)腎抗衰片對(duì)EA.hy 926細(xì)胞過(guò)氧化損傷的影響＊

張光銀，馬惠寧，李南南，王愛(ài)迪，張軍平＊＊

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 天津 300193）

目的：觀察補(bǔ)腎抗衰片對(duì)EA.hy 926細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響。方法：采用過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)EA.hy 926細(xì)胞損傷建立EA.hy 926細(xì)胞過(guò)氧化模型，以CCK-8法評(píng)價(jià)模型。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、H2O2過(guò)氧化損傷模型組以及補(bǔ)腎抗衰片干預(yù)組，利用CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞活力，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EA.hy 926細(xì)胞內(nèi)的總氧化水平（ROS），采用免疫熒光法檢測(cè)HO-1蛋白水平。結(jié)果：補(bǔ)腎抗衰片具有抗H2O2誘導(dǎo)的EA.hy 926細(xì)胞過(guò)氧化損傷，維持細(xì)胞氧化還原平衡狀態(tài)的效應(yīng)。結(jié)論：補(bǔ)腎抗衰片抗氧化損傷，維持細(xì)胞氧化還原平衡可能與調(diào)節(jié)HO-1蛋白水平有關(guān)。

補(bǔ)腎抗衰片 氧化應(yīng)激 EA.hy 926細(xì)胞 動(dòng)脈粥樣硬化

補(bǔ)腎抗衰片是國(guó)醫(yī)大師阮士怡先生治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的經(jīng)典名方，以“益腎健脾滌痰散結(jié)”法立方，由黨參、丹參、杜仲、桑寄生、龜板、淫羊藿、何首烏、石菖蒲、茯苓、砂仁、夏枯草、海藻等藥物組成，組方嚴(yán)謹(jǐn)，配伍獨(dú)特，臨床應(yīng)用30余載，療效卓著。近年來(lái)，本課題組對(duì)補(bǔ)腎抗衰片進(jìn)行了系統(tǒng)科學(xué)的臨床及實(shí)驗(yàn)研究[1-3]，探討其組方原理與作用機(jī)制，從氧化應(yīng)激、炎癥等多個(gè)角度闡釋了此方的藥理機(jī)制。

血紅素加氧酶-1（HO-1）是血紅素降解的限速酶，能降解血紅素生成Fe2+、一氧化碳（CO）和膽紅素，其在多種疾病中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。前期研究表明，補(bǔ)腎抗衰片介導(dǎo)的腦保護(hù)作用與其上調(diào)HO-1活性密切相關(guān)[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的EA.hy 926細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，觀察補(bǔ)腎抗衰片對(duì)EA.hy 926細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），Multiskan MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃-賽默飛世爾公司），INCO2108 型CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Memmert公司），CK-40 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥物及試劑

補(bǔ)腎抗衰片（由丹參、何首烏、夏枯草、茯苓、海藻、龜版、石菖蒲、砂仁、淫羊藿、桑寄生等組成），0.5 g/片，每片含生藥3 g（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，批號(hào)：071105）；高糖DMEM培養(yǎng)基、FBS胎牛血清（（Hyclone公司，批號(hào)分別是：AXH43870、NVJ0313），二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide）、含鐵血紅素（美國(guó)西格瑪奧德里奇有限公司，批號(hào)分別是D2650、51280）；PBS、D-PBS、胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素混合液等（北京索萊寶科技有限公司）；分析純過(guò)氧化氫（北京化學(xué)試劑公司）；羊HO-1多克隆抗體、驢抗羊FITC-IgG（美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司，批號(hào)分別是sc-7695、sc-2024）；細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，批號(hào)：CCK-8），活性氧檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：S0033）。

1.3 細(xì)胞株

人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞EA.hy926（No.CRL-2922）購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

EA.hy926細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%（V/V）胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。細(xì)胞融合80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，每2-3天以1:2進(jìn)行傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 含藥血清的制備

補(bǔ)腎抗衰片每克以蒸餾水5 mL溶解，按照體表面積法折算，給健康大耳白兔每12 h灌胃一次，連續(xù)灌服96 h；最后一次給藥1 h后心臟采血，按常規(guī)方法制作藥物血清，過(guò)0.22 μm微孔濾膜；同時(shí)采集家兔未服藥的血液，制作對(duì)照組血清。

2.3 建立EA.hy926過(guò)氧化損傷模型

參照文獻(xiàn)方法建立EA.hy926過(guò)氧化損傷模型[5]。以1×105個(gè)/孔將細(xì)胞接種于96孔板，以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)24 h后，換做1% FBS全培培養(yǎng)24 h同步化后再分別以0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、20.00 mM H2O2干預(yù)細(xì)胞2、6、12、24 h，以CCK-8法測(cè)量不同濃度H2O210% FBS全培干預(yù)下各時(shí)間點(diǎn)的OD值，以出現(xiàn)細(xì)胞LD50的10% FBS全培H2O2終濃度和干預(yù)時(shí)間作為EA.hy926細(xì)胞氧化損傷模型建立的最佳濃度和時(shí)間。

2.4 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy 926細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種于96孔板，每孔總體積200 μL，均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分組如下：①空白對(duì)照組：10% FBS正常培養(yǎng)細(xì)胞；②實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：10%兔正常血清培養(yǎng)細(xì)胞；③H2O2過(guò)氧化損傷組：EA.hy926細(xì)胞以10% 兔空白血清干預(yù)24 h后再以200 μM終濃度的H2O2干預(yù)12 h。④補(bǔ)腎抗衰片組：EA.hy 926細(xì)胞以10%補(bǔ)腎抗衰片含藥血清干預(yù)24 h后再以200 μM終濃度的H2O2干預(yù)12 h。干預(yù)完畢后，按照CCK-8試劑盒操作說(shuō)明書(shū)要求，將10 μL/孔CCK-8（5 mg·mL-1）試劑加至相應(yīng)實(shí)驗(yàn)孔中，根據(jù)顏色變化情況和細(xì)胞生長(zhǎng)情況繼續(xù)孵育4 h，然后每孔內(nèi)加入150 μL DMSO，振蕩15 min，將孔板置于酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度（A）值；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 熒光探針?lè)z測(cè)氧自由基水平

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA.hy926細(xì)胞，在6孔培養(yǎng)板內(nèi)以5×108cells/L的密度種植，加入1 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)24 h，換1 mL含1% FBS的DMEM再培養(yǎng)12 h。并以補(bǔ)腎抗衰片含藥血清作用后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，各孔分別加入濃度為10 μM的熒光探針（DCFH-DA），37℃孵育各組細(xì)胞3 h后，以Hanks液洗滌2次，每次2 min后用消化收集細(xì)胞，以Hanks液洗滌2次，加入400 μL Hanks液重懸細(xì)胞，按流式細(xì)胞儀檢測(cè)要求處理細(xì)胞并檢測(cè)105個(gè)細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm），反映細(xì)胞內(nèi)ROS生成量。

2.6 免疫熒光法檢測(cè)HO-1蛋白的表達(dá)

置有細(xì)胞爬片的24孔板吸取完上清液后，小心用鑷子將爬片取出，用玻璃膠粘貼于載玻片上，細(xì)胞面向上。將玻片置于37℃ PBS中洗3次，每次3-5 s，然后在4%多聚甲醛中固定15 min；PBS漂洗；1%BSA封閉30 min；加入1% BSA稀釋的羊HO-1多克隆抗體，置于保濕盒中于4℃雜交過(guò)夜；PBS漂洗；加入1% BSA稀釋的驢抗羊FITC-IgG于室溫雜交3 h；PBS漂洗后用30%的甘油封片，于熒光共聚焦掃描顯微鏡下觀察熒光物質(zhì)的強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為518 nm，并照相。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理-

3 結(jié)果

3.1 H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞過(guò)氧化損傷

由圖1可知，不同濃度H2O210% FBS全培干預(yù)下各時(shí)間點(diǎn)的OD值不同，長(zhǎng)時(shí)間、高濃度H2O2的氧化作用會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆損傷，甚至造成細(xì)胞死亡。CCK-8法測(cè)量不同濃度H2O210% FBS全培干預(yù)下各時(shí)間點(diǎn)的OD值顯示，0.20 mM H2O2干預(yù)12 h時(shí)的濃度為細(xì)胞半致死量（LD50）；當(dāng)H2O2濃度大于0.50 mM時(shí)，幾乎沒(méi)有貼壁細(xì)胞。故以10%補(bǔ)腎抗衰片含藥血清孵育24 h后，再以200 μmol·L-1H2O2干預(yù)12 h可作為過(guò)氧化損傷模型，此時(shí)的細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著降低，而細(xì)胞出現(xiàn)了顯著性損傷（見(jiàn)圖1）。

圖1 不同濃度H2O2分別誘導(dǎo)2、6、12、24 h對(duì)EA.hy926細(xì)胞的影響

不同H2O2濃度干預(yù)12 h時(shí)相差顯微鏡下觀察，正常EA.hy926細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈鋪路石狀鑲嵌排列。細(xì)胞為扁平多角形，邊界清楚，胞漿豐富。H2O2損傷后，細(xì)胞形態(tài)改變成團(tuán)簇狀，界限不清，細(xì)胞間隙增大，某些融合部分?jǐn)嗔?，部分區(qū)域脫落，較正常細(xì)胞有明顯改變，且發(fā)現(xiàn)，H2O2濃度越高，脫落細(xì)胞越明顯（見(jiàn)圖2）。

圖2 不同濃度H2O2誘導(dǎo)12 h后的EA.hy926細(xì)胞（×100）

3.2 補(bǔ)腎抗衰片對(duì)EA.hy926細(xì)胞活力的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，200 μmol·L-1H2O2模型組吸光度（OD）值明顯下降（P＜0.01）；與H2O2模型組相比，補(bǔ)腎抗衰片組吸光度（OD）值增大，但與模型組比較沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.076）。

圖3 補(bǔ)腎抗衰片對(duì)EA.hy926細(xì)胞活力的影響

3.3 補(bǔ)腎抗衰片對(duì)EA.hy926細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

以10%補(bǔ)腎抗衰片含藥血清孵育24 h后，再以200 μmol·L-1H2O2干預(yù)12 h，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的總抗氧能力。研究發(fā)現(xiàn)，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，200 μmol·L-1H2O2模型組活性氧熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.01）；與H2O2模型組相比，補(bǔ)腎抗衰片組保護(hù)組熒光強(qiáng)度顯著減小（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

3.4 補(bǔ)腎抗衰片對(duì)HO-1蛋白水平的影響

由圖5可知，免疫熒光法檢測(cè)各組HO-1蛋白水平檢測(cè)結(jié)果中，正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)少量HO-1陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與模型對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，模型組以200 μmol·L-1H2O2干預(yù)12 h時(shí)后，大量細(xì)胞固縮為圓球狀，補(bǔ)腎抗衰片含藥血清孵育24 h，再以200 μmol·L-1H2O2干預(yù)12 h時(shí)，視野內(nèi)大量綠色熒光區(qū)域，在胞質(zhì)內(nèi)也有少量熒光陽(yáng)性表達(dá)。

圖4 補(bǔ)腎抗衰片對(duì)ROS水平的影響

圖5 補(bǔ)腎抗衰片對(duì)HO-1蛋白水平的影響(熒光共聚焦×200)。

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的形成是一個(gè)由多因素參與的漫長(zhǎng)復(fù)雜病理過(guò)程，氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。當(dāng)體內(nèi)氧化/抗氧化水平失衡時(shí)，活性氧（ROS）增加，引起內(nèi)皮細(xì)胞通透功能障礙以及膜穩(wěn)定性失衡，粘附分子、炎癥因子等活躍表達(dá)，繼而引發(fā)血管舒張功能障礙、血管重構(gòu)等級(jí)聯(lián)效應(yīng)[6]。血紅素氧合酶（Heme Oxygenase，HO）是熱休克蛋白家族中的一個(gè)成員，是一種體內(nèi)廣泛存在的抗氧化防御酶，HO-1是HO的一種同工酶。HO-1分解產(chǎn)物的抗氧化和細(xì)胞保護(hù)作用以及其本身的可誘導(dǎo)性，使得HO-1具有獨(dú)特的抗氧化生理特性，并在動(dòng)脈粥樣硬化的防治中起到重要作用。在多種心血管疾病如心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷和心力衰竭的研究中，采用藥理學(xué)方法或基因方法促使HO-1蛋白表達(dá)增加能抑制心肌細(xì)胞損傷[7，8]。Yu J等[9]研究表明，芍藥苷可通過(guò)激活Nrf-2/ HO-1通路保護(hù)伽瑪輻射誘導(dǎo)的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

補(bǔ)腎抗衰片具有益腎健脾、滌痰散結(jié)之功效。該方中以茯苓、石菖蒲祛痰開(kāi)竅，丹參通絡(luò)活血，配伍淫羊藿、桑寄生及何首烏等益精填髓、調(diào)補(bǔ)肝腎，整方令氣血和暢，脾腎健旺，五臟經(jīng)脈條達(dá)，以此達(dá)到抗氧化損傷保護(hù)血管，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，中藥復(fù)方制劑補(bǔ)腎抗衰片在動(dòng)脈粥樣硬化病變中具有抗氧化作用，這種作用可能是通過(guò)調(diào)控HO-1mRNA基因的表達(dá)以及影響HO-1/ CO-cGMP通路中相關(guān)酶的活性，同時(shí)通過(guò)對(duì)抗過(guò)氧化反應(yīng)穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎抗衰片能夠阻抑H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞活力下降，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V FITC/PI染色和ROS活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎抗衰片能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞過(guò)氧化損傷，補(bǔ)腎抗衰片的這種細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)可能由HO-1相關(guān)信號(hào)通路介導(dǎo)，并通過(guò)維持細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)和活性氧之間的平衡狀態(tài)而調(diào)控氧化應(yīng)激。

1 張光銀,李明,許穎智,等. 動(dòng)脈粥樣硬化家兔蛋白質(zhì)硝基化修飾及補(bǔ)腎抗衰片干預(yù)研究. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(9):179-184.

2 趙志強(qiáng),王強(qiáng),趙忱,等. 加載補(bǔ)腎抗衰片治療腎虛痰瘀型冠心病心絞痛的臨床研究. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2012,10(9):1025-1027.

3 張軍平,許穎智,李明,等. 補(bǔ)腎抗衰片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化氧化應(yīng)激狀態(tài)的干預(yù). 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2009,15(4):279-281.

4 張光銀,張軍平,李明,等. 補(bǔ)腎抗衰片對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化家兔海馬氧化應(yīng)激的影響. 中華中醫(yī)藥雜志, 2011,26(5):1228-1231.

5 Li J, Ge R, Zhao C, Tang L, et al. Farrerol regulates occludin expression in hydrogen peroxide-induced EA.hy926 cells by modulating ERK1/2activity. Eur J Pharmacol, 2014, 734: 9-14.

6 Perrotta I, Aquila S. The role of oxidative stress and autophagy in atherosclerosis. Oxid Med Cell Longev, 2015:130315.

7 He X H, Li Q W, Wang Y L, et al. Transduced PEP-1-heme oxygenase-1 fusion protein reduces remote organ injury induced by intestinal ischemia/reperfusion. Med Sci Monit, 2015, 21:1057-1065.

8 Zhang C Y, Li X H, Zhang T, et al. Hydrogen sulfide upregulates heme oxygenase-1 expression in rats with volume overload-induced heart failure. Biomed Rep, 2013,1(3):454-458.

9 Yu J, Zhu X, Qi X, et al. Paeoniflorin protects human EA.hy926 endothelial cells against gamma-radiation induced oxidative injury by activating the NF-E2-related factor 2/heme oxygenase-1 pathway. Toxicol Lett, 2013, 218(3):224-234.

10 張光銀,李明,許穎智,等. 補(bǔ)腎抗衰片干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的氧化應(yīng)激機(jī)制研究. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2014,16(5):156-161.

Impacts of Bushen Kangshuai Tablet on its Oxidative Damage to EA.hy 926 Cells

Zhang Guangyin, Ma Huining, Li Nannan, Wang Aidi, Zhang Junping
(First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China)

This study aimed to observe the impacts of Bushen Kangshuai tablet (BSKS) on its oxidative damage toEA.hy 926 cells. In the study， peroxidation model of EA.hy 926 cells was established by Hydrogen peroxide (H2O2) injury using CCK-8 evaluation models. The cells was divided into the blank control group， the experimental control group， the H2O2group and the oxidative injury model BSKS tablet intervention group. The determination of cell viability with CCK-8 method and flow cytometry were adopted to detect the total oxidation level (ROS) in EA.hy926 cells， while immunofluorescence method was to quantify the protein level of HO-1. It was found that BSKS tablet performed an anti-oxidative damage effect on EA.hy926 cells induced by H2O2， and maintained the cellular redox balance. It was concluded that this effect could be mediated by HO-1 signal pathway.

Bushen Kangshuai Tablets， oxidative stress， EA.hy926 cells， atherosclerosis

10.11842/wst.2016.09.016

R966

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-05-13

修回日期：2015-11-21

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81173244）：基于外膜損傷從Rho/ROCK通路探討補(bǔ)腎抗衰片干預(yù)早期動(dòng)脈粥樣硬化形成的實(shí)驗(yàn)研究，負(fù)責(zé)人：張軍平。

＊＊ 通訊作者：張軍平，本刊編委，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療心腦血管疾病的臨床與科研工作。