呼雪慶，陳 健，陳啟龍，陸奕宇，蘇式兵

（上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)復雜系統(tǒng)研究中心 上海 201203）

慢性乙型肝炎和肝硬化“異病同證”的全基因組甲基化分析＊

呼雪慶，陳 健，陳啟龍，陸奕宇，蘇式兵＊＊

（上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)復雜系統(tǒng)研究中心 上海 201203）

目的：本文從全基因組DNA甲基化的角度探討慢性乙型肝炎（慢乙肝）和慢乙肝后肝硬化（肝硬化）濕熱內蘊證、肝郁脾虛證和肝腎陰虛證異病同證的生物學基礎。方法：采取慢乙肝及肝硬化濕熱內蘊證、肝郁脾虛證和肝腎陰虛證患者和健康志愿者外周血樣本，提取DNA進行HumanMethylation450K芯片檢測及分析。結果：慢乙肝和肝硬化異病同證濕熱內蘊證特異性差異甲基化位點有9個，覆蓋9個基因；肝郁脾虛證有30個，覆蓋20個基因；肝腎陰虛證有22個，覆蓋14個基因。其中，與正常組相比，濕熱內蘊證中KCTD2和NAV1，肝郁脾虛證中LGR6和SH2D4B及肝腎陰虛證中CYP2E1、PCSK6、DEXI、HIST1H3B和SULT1C2的差異位點甲基化程度變化較大（|Delta Beta|＞0.15）。結論：慢乙肝與肝硬化基因甲基化可能與其濕熱內蘊證、肝郁脾虛證和肝腎陰虛證的形成有關。

DNA甲基化 慢性乙型肝炎 肝硬化 證候 異病同證

中醫(yī)證候是中醫(yī)學理論體系指導下，一定階段的臨床癥狀與體征所反應的病理實質的概括。中醫(yī)證候具有相兼性、動態(tài)性和復雜性，且缺乏微觀層次的認識和辨證方法，為證候的客觀化，即證候形成和演變機制及證候診斷標準帶來了挑戰(zhàn)。不同疾病，其發(fā)病及轉歸機制可能存在相同或相似點，即異病同證。不同疾病的患者可能有相似的物質群變化，可采取異病同治。異病同證的深入研究為現(xiàn)代個體化診療和精準醫(yī)學發(fā)展提供依據(jù)，為疾病發(fā)病機制探索和治療提供參考[1]。

全球約有2.4億慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者，其發(fā)病機制主要涉及機體免疫和炎癥反應[2]。慢乙肝的形成因素包括HBV基因多型性、機體免疫相關基因多態(tài)性以及宿主免疫細胞的功能失調。慢乙肝后肝硬化（肝硬化）由慢乙肝發(fā)展形成，長期持續(xù)的炎癥反應激活肝星狀細胞（Hepatic Stellate Cell，HSCs），肝內結締組織異常增生，肝內彌漫性細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）過度沉淀，最終導致肝硬化。宿主感染HBV后，通過上調甲基化轉移酶（DNA Methyltransferase，DNMT）對病毒基因組進行甲基化修飾，抑制其復制，另一方面，DNMT的升高也使宿主某些基因高甲基化，而利于病毒復制，甚至激活HSC和促進肝硬化的發(fā)展[3]。HBV感染的急、慢性階段及肝硬化中均存在差異甲基化基因[4-6]。本文從全基因組DNA甲基化的角度探討慢乙肝及肝硬化異病同證（濕熱內蘊證、肝郁脾虛證和肝腎陰虛證）的生物學基礎，為證候的客觀化及慢乙肝和肝硬化的個體化診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

實驗組慢乙肝及肝硬化患者各15例，正常組健康志愿者6例均來自上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，包括慢乙肝和肝硬化的濕熱內蘊證各5例、脾虛濕盛證各5例和肝腎陰虛證各5例?；颊呔驮\時由主治醫(yī)生辨證，并通過證候問卷表采集患者證候相關臨床信息，交由3名正高職稱的中醫(yī)肝病專家確定證候類型，兩次辨證一致的患者納入本研究。采集患者和健康者空腹外周靜脈血，置入抗凝管內后，及時分離血漿和血細胞，分別速凍于-80℃冰箱，血細胞用于提取DNA。

1.2 診斷標準、納入標準和排除標準

慢乙肝的診斷標準參照2005年12月中華醫(yī)學會肝病學分會、感染病學分會制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[7]，其證候診斷標準參照《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標準（試行）》[8]。肝炎后肝硬化診斷標準參照《病毒性肝炎防治方案》[9]，其證候診斷標準參照《肝硬化臨床診斷，中西辨證和療效評定標準（試行方案）》[10]。納入標準：①符合慢乙肝及肝硬化疾病診斷標準；②中醫(yī)辨證為濕熱內蘊證、脾虛濕盛證和肝腎陰虛證；③年齡18-65歲；④簽署知情同意書。排除標準：①年齡＜18歲或＞65歲；②合并其它嗜肝病毒感染、脂肪肝、自身免疫性疾病等肝臟疾病；③慢性重型肝炎、肝硬化失代償；④伴有心、腎、肺、內分泌血液、代謝及胃腸道嚴重原發(fā)?。虎菥癫』颊?、孕婦或哺乳期婦女。

1.3 DNA提取和全基因組甲基化檢測

采用血液基因組DNA提取試劑盒TIANamp Blood DNA Kit（北京天根生化科技有限公司，貨號：DP318）提取DNA。采用HumanMethylation450K芯片技術檢測全基因組甲基化，委托上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司實施。該芯片檢測485、577個甲基化位點，覆蓋96%的已知CpG島和99%的NCBI參考序列基因。

1.4 全基因組甲基化分析

將原始數(shù)據(jù)導入Genomestudio（美國Illunina公 司，版 本：genomestudio software 2011.1）進 行BMIQ標準化。CpG位點的甲基化程度由Beta值衡量，Illunina甲基化芯片針對每一個CpG位點設計兩種探針，用雙色熒光信號signalB和signalA來檢測甲基化和非甲基化的等位基因。Beta值即為signal B強度與signal A，Signal B強度之和比值。Beta值的取值范圍為0到1，0表示該位點無甲基化，1表示該位點完全甲基化。組間甲基化差異統(tǒng)計采用One-Way ANOVA計算方法。差異甲基化位點的判斷標準為Diffscore值小于-13或大于13，且Beta差值大于0.1或小于-0.1。將差異甲基化位點所在的基因導入DAVID基因功能分析平臺＊＊ https://david.ncifcrf.gov，進行Gene ontology（GO）功能和KEGG通路分析。

2 結果與分析

2.1 慢乙肝和肝硬化患者證候與健康者臨床資料

慢乙肝和肝硬化濕熱內蘊證、肝郁脾虛證、肝腎陰虛證及正常組7組的年齡、性別在統(tǒng)計學上無差異。在ALT水平上，慢乙肝，肝硬化和正常組三組間有統(tǒng)計學差異（P=0.035）。各證候在慢乙肝與肝硬化間無統(tǒng)計學差異。在AST水平上，慢乙肝，肝硬化和正常組三組間無統(tǒng)計學差異（P=0.079）。各證候在慢乙肝與肝硬化間無統(tǒng)計學差異。在ALb水平上，組別之間都無統(tǒng)計學差異（表1）。

表1 慢乙肝和肝硬化患者證候與正常組的臨床資料（±s）

表1 慢乙肝和肝硬化患者證候與正常組的臨床資料（±s）

正常組 — 6 40.00±11.49 2/4 16.17±2.19 20.83±5.43 42.17±3.29

2.2 慢乙肝和肝硬化異病同證證候特異性差異甲基化基因

慢乙肝和肝硬化濕熱內蘊證特異性差異甲基化位點有9個，覆蓋9個基因；肝郁脾虛證有30個，覆蓋20個基因；肝腎陰虛證有22個，覆蓋14個基因（圖1）。慢乙肝和肝硬化與正常組相比，在同一證型中，差異甲基化位點的甲基化變化方向一致，即同為高甲基化或低甲基化。同一基因可能會出現(xiàn)多個差異甲基化位點，分布于基因的不同區(qū)域及CpG島相關區(qū)域，且同一基因的不同甲基化位點的甲基化變化方向一致。如肝郁脾虛證中，慢乙肝和肝硬化在GREM2基因上存在4個差異甲基化位點，與正常組相比，均發(fā)生了去甲基化，其中有3個位點位于基因body區(qū)，1個位點位于3’UTR。2個位點位于CpG島上，另外2個位點位于CpG島的shore區(qū)域。又如，肝腎陰虛證中，慢乙肝和肝硬化在CYP2E1基因上存在8個差異甲基化位點，與正常組相比，均發(fā)生了高甲基化，8個差異甲基化位點都分布在基因Body區(qū)，其中，4個位點位于CpG島上，另外4個位點位于CpG島的shore區(qū)域。慢乙肝和肝硬化與正常組相比，|DeltaBeta|＞0.15的差異甲基化基因信息如表2。

圖1 慢乙肝和肝硬化濕熱內蘊證、肝郁脾虛證和肝腎陰虛證差異甲基化位點VENN分析

慢乙肝和肝硬化濕熱內蘊證、肝郁脾虛證和肝腎陰虛證差異高甲基化位點比例均低于低甲基化位點（濕熱內蘊證：30%/70%；肝郁脾虛證：22%/78%；肝腎陰虛證：45%/55%）。濕熱內蘊證和肝郁脾虛證的差異甲基化位點主要位于1號染色體，分別占11.11%和30.00%，而在肝腎陰虛證中，差異甲基化位點主要位于10號染色，占31.82%。各證型差異甲基化位點主要存在于基因Body區(qū)（分別占44.44%，43.33%和77.27%），TSS200（分 別 占22.22%，23.33%和4.55%）和TSS1500（分 別 占22.22%，3.33%和9.09%），3個證型基因區(qū)域構成比差異無統(tǒng)計學意義（圖2）。慢乙肝和肝硬化與正常組相比，以|Delta Beta|＞0.15為閥值，濕熱內蘊證中，KCTD2在兩疾病中甲基化程度均較高，NAV1甲基化程度均為最低。肝郁脾虛證中，LGR6基因4個位點及SH2D4B基因1個位點在兩疾病中的甲基化程度均較高。肝腎陰虛證中，CYP2E1的7個位點和PCSK6的1個位點在兩疾病中的甲基化程度均較高。DEXI、HIST1H3B和SULT1C2在兩疾病中的甲基化程度均較低（表2）。

表2 慢乙肝和肝硬化異病同證主要差異甲基化基因的分布和甲基化程度

圖2 慢乙肝和肝硬化異病同證全基因組差異甲基化位點區(qū)域分布

2.3 慢乙肝和肝硬化證候特異性差異甲基化基因GO功能和KEGG通路分析

慢乙肝和肝硬化不同證候的差異甲基化基因參與不同的GO功能及KEEG通路。如圖3所示，慢乙肝和肝硬化的濕熱內蘊證差異甲基化基因主要參與一些代謝過程，比如喹啉代謝，二羧酸代謝和類維生素A代謝等以及脂肪酸的氧化作用和降解過程等；肝郁脾虛證的差異甲基化基因主要參與免疫調節(jié)相關生物學過程，如免疫反應，刺激反應和信號調控，以及移植物抗宿病、甲狀腺癌和哮喘等與免疫相關的疾??；肝腎陰虛證的差異甲基化基因參與免疫反應及一些代謝過程，如對刺激的細胞反應，信號調控，以及亞油酸代謝和類固醇激素的合成等過程。

圖3 慢乙肝和肝硬化證候特異性差異甲基化基因GO功能和KEGG通路分析

3 討論

表觀遺傳學和中醫(yī)學存在理論上的共性，如表觀遺傳修飾水平受環(huán)境、情緒和飲食的影響與中醫(yī)整體觀、七情致病理論存在共性。表觀遺傳DNA序列不變，表達水平可變與中醫(yī)“同病異證”和“異病同證”存在相似之處[11，12]。DNA甲基化是表觀遺傳學最重要的修飾方式之一。導致DNA甲基化的不同途經可形成不同的證候特征[13，14]。

近年來，從DNA甲基化角度探索中醫(yī)證候實質的研究有了初步進展，如急性骨髓性白血病患者中，與氣陰兩虛證相比，血瘀痰凝證和熱毒蘊結證ID4基因甲基化程度較高[15]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1和ADAMTS9，NUDT1和YES1，APOA5和PRKCZ等基因的差異甲基化可能分別與乙肝后肝硬化濕熱內蘊證，脾虛濕盛證和肝腎陰虛證證候的形成有關[16]。目前從DNA甲基化分子機制研究證候的生物學基礎仍在初始階段，且大多局限于單個或幾個基因與證候間的關系，缺乏從全基因組甲基化層面闡釋異病同證實質的研究。本研究從全基因組DNA甲基化的角度探討慢乙肝及肝硬化異病同證的生物學基礎。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，慢乙肝和肝硬化的同一證型存在共同的差異甲基化基因，濕熱內蘊證特異性差異甲基化位點有9個，覆蓋9個基因；肝郁脾虛證有30個，覆蓋20個基因；肝腎陰虛證有22個，覆蓋14個基因。同一基因上可能存在幾個差異甲基化位點，且不同疾病在同一差異位點上的甲基化方向一致，如肝郁脾虛證中的GREM2上有4個差異甲基化位點，且在慢乙肝和肝硬化中都發(fā)生了去甲基化。LGR6上4個差異甲基化位點在兩疾病中都呈高甲基化。肝腎陰虛證中CYP2E1上8個差異甲基化位點均呈高甲基化。差異甲基化位點分布于基因不同區(qū)域（主要集中于基因Body區(qū)域）及不同染色體上。其中，濕熱內蘊證和肝郁脾虛證的差異甲基化位點主要分布于1號染色體，肝腎陰虛證主要分布于10號染色體。進一步分析發(fā)現(xiàn)慢乙肝和肝硬化的濕熱內蘊證特異性差異甲基化基因主要參與某些代謝過程；肝脾脾虛證主要參與免疫相關過程；而肝腎陰虛的差異甲基化基因同時參與代謝過程及免疫反應。研究提示不同疾病相同證候可能存在共同的差異甲基化基因和差異甲基化位點，并具有類似的生物學過程。

濕熱內蘊證證候特異性甲基化基因中，KCTD2在慢乙肝和肝硬化中甲基化程度均較高，KCTD2參與cAMP依賴性蛋白激酶（PKA）及神經性疼痛信號通路。研究表明，KCTD2的基因多態(tài)性與阿爾茨海默病的發(fā)生有關[17]。NAV1在兩個疾病中均發(fā)生了去甲基化，NAV1參與神經系統(tǒng)發(fā)育和再生及神經元遷移[18]。目前尚未查到KCTD2和NAV1與中醫(yī)證候或其甲基化研究的相關報道。肝郁脾虛證證候特異性甲基化基因中，慢乙肝和肝硬化在LGR6的4個位點和SH2D4B的1個位點上呈現(xiàn)高甲基化。LGR6抑制Wnt信號通路的激活，LGR6是指甲干細胞，表皮干細胞的標記[19，20]，也有報道稱LGR6是一個潛在的抑癌基因[21]。SH2D4B與淋巴細胞性血管炎有關，也是T細胞特異性的適應蛋白之一，參與細胞內信號傳導[22]。肝腎陰虛證證候特異性甲基化基因中，慢乙肝和肝硬化在CYP2E1的7個位點及PCSK6呈高甲基化，DEXI、HIST1H3B和SULT1C2均發(fā)生了去甲基化。CYP2E1參與膽固醇、類固醇等脂質的合成，其基因多態(tài)性可能與的鼻咽癌、肺癌等疾病的發(fā)生有關[23，24]。研究發(fā)現(xiàn)，胎兒肝中，CYP2E1基因的不表達可能與其5’UTR的甲基化有關[25]，人體肺、腎及足月胎盤中，CYP2E1基因第一個外顯子及第一個內含子的甲基化影響其表達水平[26]，人胚胎干細胞源性肝細胞中，CYP2E1的低表達與其第一個內含子的CpG位點的高甲基化有關[27]。另有研究指出，CYP2E1基因啟動子區(qū)的甲基化程度與甲苯暴露及吸煙有關[28]。PCSK6的高表達與風濕性關節(jié)炎、鱗狀上皮細胞癌和骨關節(jié)炎疼痛等有關[29-31]。DEXI基因功能不明確，研究稱CLEC16A基因的多態(tài)性通過影響鄰近基因DEXI的表達，介導1型糖尿病及多發(fā)性硬化的發(fā)生[32，33]。結直腸癌及胃癌中，DEXI呈高甲基化狀態(tài)，且可能參與對化療藥喜樹堿的耐藥過程[34]。HIST1H3B編碼組蛋白，彌漫性的內源性腦干膠質瘤中常出現(xiàn)HIST1H3B基因突變[35]。SULT1C2編碼的蛋白屬磺基轉移酶，磺基轉移酶催化激素、神經傳遞素，外源性物質等的硫酸鹽共軛。膽固醇生物合成中間體會影響大鼠原代肝細胞中SULT1C2的表達[36]。

上述基因甲基化與參與證候形成的具體機制仍需進一步探索。目前關于甲基化的研究，主要集中于其參與調控基因的轉錄水平，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。一般認為，基因啟動子區(qū)CpG位點的甲基化通常抑制轉錄，而去甲基化通常促進轉錄。近年來，關于基因其它區(qū)域的CpG位點的甲基化所與轉錄關系的研究增多，研究稱基因Body區(qū)域的甲基化能促進轉錄[37]，也有研究表明基因Body區(qū)域甲基化程度極高或極低能夠抑制轉錄，而中等水平的甲基化程度則促進轉錄[38-41]?；虻谝粋€外顯子上的甲基化與轉錄抑制有關[42]。因此，基因甲基化也可能通過調控其轉錄水平，參與證候的形成。

綜上，濕熱內蘊證中KCTD2和NAV1，肝郁脾虛證中LGR6和SH2D4B及肝腎陰虛證中CYP2E1、PCSK6、DEXI、HIST1H3B和SULT1C2的甲基化程度的改變可能與其相應證候的形成有關，其機制之一可能是通過影響基因轉錄，從而影響其生物學過程，參與證候形成，具體機制還需進一步的研究。該研究因樣本量較少，存在一定的局限性，基因的甲基化程度需后續(xù)大樣本的驗證。

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Genome-Wide Methylation Analysis in the Same Syndrome Between the Chronic Hepatitis B and Hepatitis B-Related Cirrhosis

Hu Xueqing, Chen Jian, Lu Yiyu, Su Shibing
(Research Center for Traditional Chinese Medicine Complexity System, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

This study aimed to explore the biological basis of the same syndrome of Traditional Chinese Medicine (TCM) in different diseases， involving dampness and heat excess (DH) syndrome， liver stagnation and spleen deficiency (LSSD) syndrome and liver- and kidney-yin deficiency (LKYD) syndrome in chronic hepatitis B (CHB) and hepatitis B-related cirrhosis (LC). The CHB and LC patients with DHS， LSSDS and LKYDS (10 cases apiece) and healthy volunteers (6 cases) were enrolled. Blood samples were prepared and DNAs were extracted for HumanMethylaiton450K detection and analyses. As a result， 9 loci (covering 9 genes) were specifically and differently methylated in DH syndrome in both the two diseases， while 30 loci (covering 20 genes) in LSSD syndrome and 22 loci (covering 14 genes) in LKYD syndrome. Among the genes， KCTD2 and NAV1 in DH syndrome， LGR6 and SH2D4B in LSSD syndrome， and CYP2E1， PCSK6， DEXI， HIST1H3B and SULT1C2 in LKYD syndrome were significantly differently methylated compared with the healthy group (|Delta Beta| ＞ 0.15). In conclusion， methylation level alternation may involve in the formation of DH， LSSD and LKYD syndromes in CHB and LC.

DNA methylation， chronic hepatitis B， cirrhosis， TCM syndrome， the same TCM syndrome in different diseases?

10.11842/wst.2016.09.004

R2-031

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-07-12

修回日期：2016-08-25

＊ 國家自然科學基金委重點項目（81330084）：基于系統(tǒng)生物學的原發(fā)性肝癌和大腸癌“異病同證”和“異病同治”的研究，負責人：蘇式兵。

＊＊ 通訊作者：蘇式兵，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫(yī)藥系統(tǒng)生物學。