陳丹丹黃清泉*施暢趙寶紅

脫細(xì)胞粘膜基質(zhì)的熱原試驗(yàn)研究

陳丹丹1黃清泉1*施暢2趙寶紅3

目的 考察脫細(xì)胞粘膜基質(zhì)的熱原試驗(yàn)方法的可行性。方法依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版二部附錄XIE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和ISO10993.12 Biological evaluationofmedicaldevices-Part 12：Sample preparation and reference materials，使用離心法消除樣品浸提液的懸浮顆粒，使用動(dòng)態(tài)濁度法驗(yàn)證離心條件是否會(huì)影響浸提液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)。依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版三部附錄XIID熱原檢查法檢測(cè)脫細(xì)胞粘膜基質(zhì)的熱原試驗(yàn)是否合格。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)中采用的離心條件不會(huì)影響樣品浸提液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)，熱原試驗(yàn)合格。結(jié)論該產(chǎn)品可以采用此離心條件進(jìn)行熱原檢測(cè)。

脫細(xì)胞粘膜基質(zhì)；熱原試驗(yàn)；動(dòng)態(tài)濁度法

脫細(xì)胞粘膜基質(zhì)是用豬的正常小腸組織，經(jīng)脫細(xì)胞去抗原技術(shù)制備而成。可用于疝、瘺等軟組織缺損修復(fù)及增強(qiáng)。

熱原實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行z測(cè)醫(yī)療器械和生物材料中的以細(xì)菌內(nèi)毒素為主的熱原物質(zhì)，降低臨床熱原反應(yīng)的發(fā)生率。由于產(chǎn)品特性，脫細(xì)胞粘膜基質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間浸泡于浸提液中會(huì)有不溶性顆粒物質(zhì)（膠原蛋白不溶性顆粒），不能直接用于熱原試驗(yàn)中家兔的耳緣靜脈注射。在中國(guó)藥典2010年版一部附錄IXR不溶性微粒檢查法中規(guī)定不溶性顆粒不能用于靜脈注射[1]，在ISO-10993.12中規(guī)定浸提液必須進(jìn)行離心以去除懸浮粒子時(shí)，應(yīng)說明理由[2]。本研究為除去浸提液中的懸浮顆粒，擬采用離心條件：7500轉(zhuǎn)，30分鐘（該離心條件和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝中的離心條件一致）。為證實(shí)此離心條件是否會(huì)影響浸提液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，筆者做了如下研究。這個(gè)離心條件如果經(jīng)過驗(yàn)證不會(huì)影響浸提液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，對(duì)于其他可降解的醫(yī)療器械產(chǎn)品有可能導(dǎo)致的浸提液中含有懸浮顆粒和混濁，在進(jìn)行熱原試驗(yàn)時(shí)也可以考慮此離心的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及可靠性[3-6]

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行逐級(jí)稀釋，最終細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為1.0EUomL-1、0.1EUomL-1、0.01 EUomL-1稀釋系列；各取0.1mL分別加到預(yù)先加有0.1 mL TAL試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，立即插入32孔動(dòng)態(tài)試管儀內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，其中每一濃度重復(fù)3管。

1.2.2 樣品溶液的制備

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行逐級(jí)稀釋，最終獲得細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.2EUomL-1的溶液，取其中37 mL溶液在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后離心，另取37 mL溶液在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后不離心。之后這2份溶液同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素定量測(cè)試。

1.2.3 樣品溶液正式試驗(yàn)[7-10]

分別取2份制備好的溶液，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋2倍，記為Ai液；同時(shí)另取2份制備好的溶液，并在溶液中添加濃度為0.2EUomL-1的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，記為Bi液；分別取上述各液0.1 mL，加入0.1 mL TAL試劑的反應(yīng)管進(jìn)行檢測(cè)，其中每一個(gè)濃度重復(fù)2管，計(jì)算回收率。

1.2.4 熱原試驗(yàn)

取脫細(xì)胞粘膜基質(zhì)（批號(hào)：120201，陜西瑞盛生物科技有限公司，規(guī)格：SIS-T5）表面積118cm2，置于一個(gè)無熱原的玻璃廣口瓶中，加入94mL氯化鈉注射液，在（37±1）℃下浸提72小時(shí)后，浸提液在7500轉(zhuǎn)離心30分鐘后用于家兔耳緣靜脈注射，操作方法按照中國(guó)藥典2010年版三部附錄XIID熱原檢查法進(jìn)行[11]。

2 結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及可靠性的結(jié)果見附表1?；貧w方程：lgT= 2.7494－ 0.3006lgC，其中，相關(guān)系數(shù) r=-0.9982；最低濃度1=0.01 EUomL-1，空白對(duì)照管在檢測(cè)時(shí)間外，故標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性（n=3）

樣品溶液正式試驗(yàn)中的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)結(jié)果見附表2。標(biāo)準(zhǔn)曲線：lgT=2.8731－0.2635lgC，其中，相關(guān)系數(shù)r= -0.9966，2份供試溶液的2倍稀釋液回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，表明供試液在本實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)TAL試劑無干擾影響。在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，離心前和離心后溶液中的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別是0.170EUomL-1，0.196EUomL-1，都接近添加的0.2EUomL-1的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。所以該離心條件：7500轉(zhuǎn)，30分鐘，不會(huì)影響溶液中的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度。

表2 供試品溶液正式試驗(yàn)（n=2）

熱原試驗(yàn)的結(jié)果是三只家兔的升溫幅度分別為：0.2℃，0.0℃，0.0℃，升溫總和為0.2℃。符合藥典中規(guī)定要求：初試3只家兔體溫升高均低于0.6℃，且升溫總和低于1.3℃。所以熱原檢測(cè)合格。在驗(yàn)證離心條件的試驗(yàn)中，細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0.2 EUomL-1，離心后溶液中的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度0.196EUomL-1，差別只有0.004 EUomL-1。

3 討論

3.1 由于脫細(xì)胞粘膜基質(zhì)的浸提液中含有懸浮顆粒和混濁，不能直接進(jìn)行家兔耳緣靜脈注射。浸提液必須在注射前進(jìn)行離心處理，采用的離心條件和樣品制備工藝一致。通過動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)的方法，發(fā)現(xiàn)離心不會(huì)影響溶液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。所以在對(duì)脫細(xì)胞粘膜基質(zhì)進(jìn)行熱原檢測(cè)時(shí)，可以采用此離心條件。同時(shí)本研究說明：對(duì)于其他可降解的醫(yī)療器械產(chǎn)品有可能導(dǎo)致的浸提液中含有懸浮顆粒和混濁，在進(jìn)行熱原試驗(yàn)時(shí)也可以考慮采用離心的方法。

3.2 由于本研究中使用的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品在外環(huán)境中的穩(wěn)定性要低于實(shí)際外環(huán)境中存在的細(xì)菌內(nèi)毒素的穩(wěn)定性，所以本研究考察了在37℃培養(yǎng)1小時(shí)的情況，以得到準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

3.3 脫細(xì)胞粘膜基質(zhì)的熱原試驗(yàn)結(jié)果合格。

[1]中華人民共和國(guó)藥典[M].一部.附錄，IXR：不溶性微粒檢查法，2010：58-60.

[2]ISO10993.12 Biological evaluation of medical devices-Part 12：Sample preparation and reference materials

[3]中華人民共和國(guó)藥典[M].二部.附錄，XIE：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，2010：99-102.

[4]萬麗卿，唐黎明.血漿中細(xì)菌內(nèi)毒素定量測(cè)定方法的研究[J].藥物分析雜志，2012，32（9）：1677-1682.

[5]祝清芬，魏霞．動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定多西他賽注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量[J].中國(guó)藥房，2011，22（1）：54-55.

[6]姚明達(dá)，黃仙梅，王梅娟．動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)舒肝寧注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46（3）：239-240.

[7] 王莉蓓，陳華龍，姜麗君.動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)血栓通注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素[J].齊魯藥事，2011，30（1）：27-28.

[8]黃云戰(zhàn)，劉金明，湯瑜.纖維蛋白原細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)中干擾因素的分析與排除[J].齊魯藥事，2010，29（4）：215-217.

[9]趙海欣，王梅娟.動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)茵梔黃注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，19（10）：53-54.

[10]勞海燕，林秋曉，馮聚錦.注射用頭孢菌素類抗生素細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)比濁定量法的研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36（3）：234-237

[11]中華人民共和國(guó)藥典[M].三部.附錄，XIID：熱原檢查法，2010：94-95.

Pyrogen test of decellularized mucosa matrix

Chen Dandan1,Huang Qingquan1,Shi Chang2,et al.
1 National Institute for the Control of food and Pharmaceutical Products,Beijing,100050;2 Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology,National Beijing Center for New Drug SafetyEvaluationandResearch,Beijing,100850;3Planting Center,Hospitalof Stomatology,China Medical University, Shenyang Liaoning,110002,China

Objective The research investigates the feasibility of pyrogen test for decellularized mucosa matrix.Methods The sample extract liquid was prepared according to the ISO 10993 Biological evaluation of medical devices-Part 12：Sample preparation and reference materials.And the suspended particles were removed by centrifugation.To inspect whethercentrifugation will influence the bacterium endotoxinconcentration of the extract liquid,kineticturbiditymethodwasperformedaccording to the Chinese pharmacopoeia 2010editionappendix XIE.Thenpyrogentestofdecellularized mucosamatrixwasperformedaccordingto the Chinese pharmacopoeia 2010editionappendix XIID.Result Theprocedure of centrifugationusedin the study didn't influence the bacterium endotoxinconcentration of the sampleextract liquid.The pyrogen test result met the standard.Conclution Pyrogen test of decellularized mucosa matrix is feasible under the centrifugation condition.

Decellularized mucosa metrix;Pyrogen test;Kinetic turbidity method

R927.12；R289-03

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.04.003

swgk2015-09-00188

陳丹丹（1972-）女，碩士，副教授。研究方向：醫(yī)療器械生物安全性評(píng)價(jià)。

2015-09-23）

1中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050；2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，國(guó)家北京藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，北京100850；3中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植中心，遼寧沈陽110002