黃曉榮，張 濤，馮廣朋，趙 峰，劉鑒毅，王 妤，章龍珍，莊 平

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090）

超低溫冷凍對俄羅斯鱘精子頂體酶活性及DNA損傷的影響

黃曉榮，張 濤，馮廣朋，趙 峰，劉鑒毅，王 妤，章龍珍，莊 平

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090）

選取6 ind健康的雄性俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti），經(jīng)人工催產(chǎn)后獲得成熟的精子，研究超低溫冷凍（－196℃）對俄羅斯鱘精子頂體酶活性及DNA損傷影響。結(jié)果顯示：俄羅斯鱘鮮精中頂體酶的平均活性為（36.18±2.54）μIU·10－6，經(jīng)過超低溫冷凍后，精子頂體酶活性顯著降低，添加抗凍保護(hù)液精子中頂體酶活性降至（21.55±0.79）μIU·10－6，未添加抗凍保護(hù)液精子中頂體酶活性降至（9.58±1.08）μIU· 10－6，且三者間有顯著性差異（P＜0.05）。單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果表明，俄羅斯鱘鮮精彗星率為（37.33± 7.77）%，添加抗凍劑后凍精的彗星率為（63.67±5.13）%，未添加抗凍劑直接冷凍彗星率高達(dá)（86.00± 3.61）%，三者間有顯著差異（P＜0.05）。用CASP分析軟件分析測量彗星拖尾長度（L tail）、彗星尾部DNA的相對含量（Tail DNA）、尾動量（TM）、Olive尾動量（OTM）等各項表征DNA損傷的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)凍精組的各項指標(biāo)均顯著高于鮮精組，未添加抗凍劑直接冷凍組又高于添加抗凍劑組，3組間有顯著性差異（P＜0.05）。本研究結(jié)果表明：超低溫冷凍能導(dǎo)致精子頂體酶活性下降和DNA損傷，抗凍劑對精子具有保護(hù)作用。

超低溫冷凍；俄羅斯鱘；精子；頂體酶活性；DNA損傷

俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedti）屬鱘形目（Acipenseriformes），鱘科（Acipenseridae），鱘屬，不但肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，還具有藥用、美容、滋補(bǔ)功效，自古以來就被視為水中珍品［1］。由于過度捕撈、水電工程建設(shè)和環(huán)境污染等原因，鱘魚資源量大幅度下降并處于瀕危狀態(tài)，已經(jīng)被國際自然和資源保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）（1996）列為易危種，1997年世界瀕危動物貿(mào)易公約組織（CITES）將其列為附錄Ⅱ［2］。

精子頂體酶是精子頂體部特有的胰蛋白酶。在頂體反應(yīng)、精子和卵子透明帶的結(jié)合及穿透中起重要作用，精子頂體酶活性的高低可直接影響其受精能力［3］。在生殖醫(yī)學(xué)上，很多學(xué)者也將其作為評價男性生殖能力的一個重要指標(biāo)［4－5］。在水生生物頂體酶研究上，目前僅見鋸緣青蟹（Scylla serrata）的報道［6］。DNA作為遺傳物質(zhì)，其損傷情況將直接影響魚類精子的質(zhì)量及其下一代生長發(fā)育，因此，精子DNA損傷情況是檢測精子質(zhì)量的一個重要依據(jù)。在魚類精子DNA損傷的研究上，目前已有虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［7］、海鱸（Dicentrarchus labrax）［8］、真鯛（Pagrosomus major）［9］等相關(guān)報道，但未見鱘科魚類精子頂體酶活性及DNA損傷研究的報道。本研究利用低溫生物學(xué)的原理開展精子超低溫冷凍保存及損傷機(jī)理研究，以期對俄羅斯鱘種質(zhì)資源的保護(hù)以及養(yǎng)殖俄羅斯鱘種質(zhì)的改良起到參考作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗用親魚取自杭州千島湖鱘龍科技開發(fā)有限公司千島湖養(yǎng)殖基地，雄魚為7齡，在網(wǎng)箱中進(jìn)行養(yǎng)殖。在俄羅斯鱘繁殖季節(jié)，選取體長93.6～108.7 cm、體質(zhì)量4.27～6.18 kg的雄魚6 ind用于實驗。

1.2 精子采集

經(jīng)人工催產(chǎn)后取精。待親魚麻醉后，用直徑5 mm左右的聚丙烯塑料軟管直接插入生殖孔，輕輕擠壓腹部，讓精液流入塑料袋中，要求精液無血、無水、無糞便等污染，經(jīng)鏡檢選取精子活力90%以上者用于實驗。

1.3 樣本制備

將采集精液分為3個處理組，分別為：（1）鮮精，即對照組；（2）以10%的甲醇作為抗凍劑，以含23.4 mM蔗糖＋0.25 mM KCl＋30 mM Tris（pH 8.0）的混合溶液作為稀釋液［10］，將精液與預(yù)冷（4℃）的抗凍保護(hù)液按1∶1（V/V）混合后，裝入250μL塑料離心管，液氮面1 cm處平衡1 min后，迅速放入－196℃的液氮中保存。測定前置于38℃的水浴中解凍；（3）不添加任何抗凍劑和稀釋液，直接將精液裝入250μL塑料離心管，液氮面1 cm處平衡1 min后，迅速放入－196℃的液氮中保存。測定前置于38℃水浴中解凍。3個處理組樣本中分別取一部分用于頂體酶測定，一部分用于DNA損傷研究。

1.4 頂體酶活性測定

測定方法參考KENNEDY等［11］，并適當(dāng)加以調(diào)整。首先測定精子密度，按每管（2～10）×106cell精子數(shù)計算所需精液量；每組取5 mL離心管2個，一個為測定管，標(biāo)“T”，另一個為對照管，標(biāo)“C”；每管加A液0.5 mL，其上鋪所需精液量，1 500 r·min－1離心30 min，仔細(xì)吸出上層精漿和溶液。對照管加100μL C液，C和T管均加1.0 mL E液，混勻，25℃孵育3 h，每小時震蕩1次；添加100μL C液到所有測試管，對照管除外，震蕩，1 500 r·min－1離心30 min。調(diào)整分光光度計，在410 nm處測量，E液為空白調(diào)零，分別測定C管和T管的OD值。

酶活力計算：頂體酶的國際單位，用在23℃降解lμmol BAPNA·min－1來表示，為了獲得整數(shù)，頂體酶活力用μIU·10－6精子，活力用試驗組和對照組之間的平均差異表示［6］，各組實驗均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5 單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）實驗

SCGE參考徐西長等［8］的方法。鮮精、添加抗凍劑組和未添加抗凍劑組分別制備3個平行樣，每個平行樣都進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳檢測。將DNA損傷按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等級劃分：0級（G0）為無損傷，精子核完整；1級（G1）為輕度損傷，可見彗尾，精子核縮小；2級（G2）為中度損傷，可見明顯彗尾，精子核縮??；3級（G3）為重度損傷信號強(qiáng)而密，并見明顯縮小的精子核；4級（G4）為完全損傷，僅見熒光強(qiáng)而密的彗尾，精子核基本消失。用CASP分析軟件分析測量DNA遷移的各種參數(shù)［12］：彗星拖尾長度（L tail）、彗星尾部DNA的相對含量（Tail DNA）、尾動量（TM，即L tail× Tail DNA）、Olive尾動量（OTM，即Tail DNA×遷移DNA中心密度）等，檢測精子冷凍保存前后的DNA損傷程度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，用單因子方差分析（One-Way ANOVA）檢驗各處理組間的差異，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 超低溫冷凍對俄羅斯鱘精子頂體酶活性的影響

俄羅斯鱘鮮精中頂體酶的平均活性為（36.18±2.54）μIU·10－6，經(jīng)超低溫冷凍后，精子中頂體酶活性顯著下降，其中未添加抗凍保護(hù)液精子中頂體酶活性降至（9.58±1.08）μIU· 10－6，添加冷凍保護(hù)液精子中頂體酶活性降至（21.55±0.79）μIU·10－6。統(tǒng)計分析表明，冷凍前后各處理組間精子的頂體酶活性有顯著性差異（P＜0.05）（圖1）。

2.2 超低溫冷凍對俄羅斯鱘精子DNA損傷的影響

2.2.1 精子DNA彗星分級檢測結(jié)果

隨機(jī)選取100 cell精子，統(tǒng)計各損傷級別精子個數(shù)，計算各級別精子所占精子總數(shù)的百分比，結(jié)果見圖2，同時統(tǒng)計損傷精子占總精子數(shù)的百分比，記為彗星率，結(jié)果見圖3。

圖1 超低溫冷凍對精子頂體酶活性的影響Fig.1 Effects of cryopreservation on the acrosin activity of semen

圖2 各處理下不同等級精子的分級結(jié)果Fig.2 Classification results of each grade of semen under difference treatment

圖3 精子彗星率Fig.3 Comet rate of semen

由圖2可見，對于G0級，鮮精中無損傷精子所占比例為（69.33±3.51）%，冷凍后添加抗凍劑組精子所占比例為（36.33±5.13）%，兩者間有顯著性差異（P＜0.05）。G1級，鮮精中輕度損傷精子所占比例為（18.33±2.08）%，冷凍后添加抗凍劑組精子所占比例為（22.00±3.61）%，無添加組精子所占比例為（14.33±3.51）%，后兩者間存在顯著差異（P＜0.05）。G2級，鮮精中中度損傷精子所占比例為（12.33±2.52）%，冷凍后添加抗凍劑組精子比例為（20.67± 3.79）%，無添加組精子比例為（43.33± 1.53）%，各組間差異顯著（P＜0.05）。G3級，冷凍后添加抗凍劑組中精子重度損傷的比例為（21.00±5.20）%，無添加組為（16.67± 1.53）%，兩組間差異不顯著（P＞0.05）；但因鮮精中無重?fù)p傷的精子，因此冷凍組與鮮精存在顯著差異（P＜0.05）。對于G4級，鮮精中無完全損傷的精子，冷凍后添加抗凍劑組中完全損傷的精子所占比例為（3.33±1.53）%，無添加組中為（11.67±1.53）%，兩組間差異顯著（P＜0.05）。

由圖3可見，俄羅斯鱘鮮精彗星率為（37.33 ±7.77）%，經(jīng)過超低溫冷凍后，添加抗凍劑組凍精的彗星率為（63.67±5.13）%，未添加抗凍劑直接冷凍組彗星率高達(dá)（86.00±3.61）%，且3組間有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2.2 精子DNA損傷指標(biāo)分析

從表征DNA損傷程度的各項指標(biāo)來看（表1），鮮精組的各項指標(biāo)均顯著低于凍精組，而未添加抗凍劑直接冷凍組又顯著高于添加抗凍劑組，3組間存在顯著差異（P＜0.05）。

鮮精組經(jīng)電泳后，大部分精子的DNA在電場中幾乎不泳動，染色后成圓形的熒光團(tuán)，無拖尾現(xiàn)象，添加抗凍劑凍精組均出現(xiàn)不同程度的拖尾現(xiàn)象，未添加抗凍劑組精子DNA拖尾現(xiàn)象尤為嚴(yán)重（圖4）。

3 討論

3.1 超低溫冷凍對鱘魚精子頂體酶活性影響

鱘魚精子是由頂體、頭部、中段和一條鞭毛組成。精子頂體酶是精子頂體部特有的胰蛋白酶，為絲氨酸蛋白酶，是受精過程中一種重要的蛋白水解酶，此酶能水解卵細(xì)胞的透明帶，使得精卵能相互融合。頂體酶還能夠促進(jìn)生殖系統(tǒng)中

表1 精子冷凍前后各組DNA損傷的彗星分析Tab.1 Comet assays of DNA damage of semen after cryopreservation

圖4 精子DNA單細(xì)胞凝膠電泳圖（×400）Fig.3 Electrophoretic images of semen DNAs by SCGE（×400）

激肽的釋放，后者能夠增強(qiáng)精子的活力和促進(jìn)精子的運動。一般頂體酶是以未激活的原頂體酶前體形式存在，在頂體反應(yīng)時通過特定的蛋白水解作用而激活，頂體酶原釋放［13］。前頂體酶和頂體酶的活力是由精漿和精子中的頂體酶抑制劑控制的，主要由其中幾種絲氨酸蛋白酶抑制劑調(diào)控［14］。頂體酶活力能夠反映雄性親體繁殖能力，醫(yī)學(xué)上已將精子頂體酶作為檢測男性是否不育的一個重要指標(biāo)，同時也可作為治療效果的參照指標(biāo)，并得到廣泛的應(yīng)用和認(rèn)可，正開始轉(zhuǎn)向臨床應(yīng)用水平［15］。目前低溫對精子頂體酶活性影響報道較少，而低溫對魚類精子頂體酶活性的影響則尚未見報道。劉睿智等［16－17］研究發(fā)現(xiàn)，人精子頂體酶活性冷凍后較冷凍前顯著降低（P＜0.05），且添加不同抗凍劑和使用不同冷凍方法對精子頂體酶活性具有顯著性影響（P＜0.05）。陳田飛等［18］對家蠶（Bombyx moil）精子的研究發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍后家蠶精子頂體酶活性較冷凍前顯著降低（P＜0.05），冷凍90 d與冷凍360 d精子頂體酶活性無顯著差異。本研究中，俄羅斯鱘鮮精中頂體酶活性較高，經(jīng)超低溫冷凍后頂體酶活性顯著下降（P＜0.05），未添加冷凍保護(hù)劑組酶活性降至更低，且與添加抗凍劑組存在顯著差異（P＜0.05），這些都與上述研究結(jié)果基本一致。這一研究結(jié)果也表明超低溫冷凍會導(dǎo)致精子頂體酶活性的降低，抗凍劑能有效保護(hù)精子，減少精子頂體酶活性的喪失。

3.2 超低溫冷凍對俄羅斯鱘精子DNA損傷的影響

在堿性SCGE中并不完全是只有已存的單雙鏈斷裂位點才能形成彗尾，堿性SCGE的彗星率只是顯示了核DNA的堿性敏感位點的數(shù)目（包括核DNA單、雙鏈斷裂位點）［9］。因此SCGE檢測核DNA穩(wěn)定性的結(jié)果與精子染色體結(jié)構(gòu)分析（SCSA）和原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL）獲得的結(jié)果無法相比，但使用SCGE檢測人類冷凍精子DNA損傷的實驗中獲得的結(jié)果與SCSA和TUNEL獲得的結(jié)果明顯相關(guān)［19］。所以可通過此種方法來檢測精子核DNA的穩(wěn)定性［20］。

本研究中，由于分級標(biāo)準(zhǔn)為人為設(shè)計，且在觀察中彗尾的明顯程度不易掌握，特別是G0與G1差異在鏡下不易斷定，需要快速觀察，否則熒光會萃滅，所以在一定程度上造成了平行樣標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。雖然采用了人工分級標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計彗星率的方法，但此種方法沒有對核的彗星圖像精確度量分析、主觀性較強(qiáng)，定量化程度不夠［21］，但比較簡便實用，縮短了實驗時間，適合快速大樣品檢測。進(jìn)一步的精確分析可采用測量彗尾長度及彗星頭部暈圈直徑等數(shù)據(jù)或用專門的彗星圖像分析軟件來對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。

通常認(rèn)為冷凍條件下DNA比較穩(wěn)定，其完整性不易被破壞。STEELE等［22］對冰凍保存的人精液標(biāo)本進(jìn)行了SCGE分析，結(jié)果未顯示冷凍對精子遺傳物質(zhì)的影響。徐西長等［9］在對真鯛精子的低溫冷凍保存研究中發(fā)現(xiàn)，用30%DMSO冷凍保存后，精子DNA損傷狀況與鮮精差異明顯。陳東華等［23］在對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）精子低溫冷凍保存研究中發(fā)現(xiàn)，加入冷凍保護(hù)劑的精子與鮮精相比其DNA已出現(xiàn)不同程度的損傷，而冷凍后對蟹精子DNA的損傷程度更大，其中10%DMSO保存的精子DNA損傷最為明顯。黃曉榮等［24］研究表明，超低溫冷凍對中華絨螯蟹胚胎線粒體DNA也有一定程度的影響。ZILLI等［8］發(fā)現(xiàn)，海鱸精子經(jīng)超低溫冷凍后，其DNA損傷與鮮精存在顯著差異。CABRITA等［25］研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒和金頭鯛（Sparus aurata）精子DNA冷凍后較冷凍前出現(xiàn)明顯損傷。本研究中，冷凍后的俄羅斯鱘精子與鮮精相比其DNA出現(xiàn)明顯損傷，各項彗星分析指標(biāo)均存在顯著差異，表明超低溫冷凍對俄羅斯鱘精子DNA有顯著影響。研究同時發(fā)現(xiàn)未添加抗凍劑組精子DNA損傷指標(biāo)顯著高于添加抗凍劑組，表明抗凍劑除可以保護(hù)精子活力外，還可在一定程度上保護(hù)精子DNA免受損傷。因此，在評價俄羅斯鱘精子冷凍保存效果時，不僅要關(guān)注其解凍后的活力和壽命，同時更應(yīng)關(guān)注冷凍對精子DNA的損傷。

在實驗過程中，針對實驗材料對傳統(tǒng)的SCGE方法進(jìn)行了改進(jìn)：（1）有些學(xué)者［26－27］認(rèn)為載玻片要預(yù)熱，本實驗表明預(yù)熱的載玻片不利于凝膠與玻片的附著，容易導(dǎo)致膠的脫落，因此本實驗未對玻片進(jìn)行預(yù)熱；（2）鋪膠過程中有些學(xué)者采用了鋪三層膠的方法：底層為正常融點的瓊脂糖凝膠（NMA），頂層為LMA，中間為精子與LMA的混合液［28］；或者鋪兩層膠：底層精子與LMA的混合液，頂層為LMA［29］，但通過實驗比較，結(jié)果并無明顯差異，因此本實驗采用徐西長等［9］的方法只鋪一層膠，不僅節(jié)省了鋪膠時間，而且減少了脫膠問題，便于顯微觀察；（3）先將精子細(xì)胞預(yù)處理后再鋪膠電泳，使實驗相對容易操作，避免了鋪膠后精子細(xì)胞預(yù)處理而造成的脫膠等問題。（4）電泳時電壓、電流及時間的長短會直接影響DNA遷移長度，造成假陽性或假陰性［30］。因此，本實驗在電泳過程中一直持續(xù)監(jiān)測，根據(jù)實際情況及時吸出或加入電泳液，調(diào)節(jié)液面高度，保持電壓與電流的恒定，減少了假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

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Effects of cryopreservation on acrosin activity and DNA damage of Russian sturgeon（Acipenser gueldenstaedti）semen

HUANG Xiao-rong，ZHANG Tao，F(xiàn)ENG Guang-peng，ZHAO Feng，LIU Jian-yi，WANG Yu，ZHANG Long-zhen，ZHUANG Ping
（East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Key laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Shanghai200090，China）

Purpose：The study was conducted about the effects of cryopreservation on acrosin activity and DNA damage ofAcipenser gueldenstaedtisemen，with a view to providing references for the protection of germplasm resources and improvement of germplasm breeding of Russian sturgeon.Materials：The parents ofAcipenser gueldenstaedtiwere collected from Qiandao lake，Zhejiang Province，P.R.China and the males were 7 aged.The average length ranged 93.6～108.7 cm and average weight ranged 4.27～6.18 kg.6 mature males were selected to extract non-polluted spermatozoa through gohopore.The sperm motility was examined by microscope，and samples above 90%of sperm motility were used for this experiment.Methods：The collected semen were randomly divided into 3 groups，and they are as follows（1）Fresh semen，namely control group；（2）original semen was diluted by 1∶1 with 23.4 mM sucrose＋0.25 mMKCl＋30 mMTris（pH 8.0）and addition 10%glycol as cryoprotectants and then mixtures were placed in 250μL plastic centrifuge tube，and then samples were equilibrated for 20 min at 4℃，then 1 min at－20℃，fimally preserved in liquid nitrogen；（3）semen without diluent and cryoprotectant.The samples were placed into 250μL plastic centrifuge tube，and equilibrated for 20 min at4℃，then 1 min at－20℃，and finally preserved in liquid nitrogen.The samples were thawed in 38℃bath before determination.A portion of the samples from three groups were used to determine the acrosin activity and the rest samples were used to detect the DNA damage.The acrosin activity was determined by spectrophotometric method，and the DNA damage was studied by single cell gel electrophoresis method.Results：The average acrosin activity in fresh semen ofA.gueldenstaedtiwas（36.18±2.54）μIU·10－6After cryopreservation，The acrosin activity declined significantly.The activity of frozen semen which cryoprotectants had been added declined to（21.55±0.79）μIU·10－6，while the activity of frozen semen which cryoprotectants had not been added declined to（9.58±1.08）μIU·10－6.There were significant differences among the three groups（P＜0.05）.The results of single cell gel electrophoresis（SCGE）showed，the comet rate of fresh semen was（37.33±7.77）%，while the comet rate of frozen semen which cryoprotectants had been added was（63.67±5.13）%，and the comet rate of frozen semen which cryoprotectants had not been added was（86.00±3.61）%.There were significant differences among the three groups（P＜0.05）.DNA damage indexes including L-tail，Tail DNA，TM and OTM were analyzed with CASP software.The results showed that various indexes in frozen semen were higher than those of fresh semen and the indexes in the group without cryoprotectants were higher than those of the group with cryoprotectants.There were significant differences among the three groups（P＜0.05）.Conclusions：Cryopreservation could induce the decline of acrosin activity and DNA damage，but cryoprotectant could protect the semen in cryopreservation.

cryopreservation；Acipenser gueldenstaedti；semen；acrosin activity；DNA damage

S 917

A

1004－2490（2016）05－0487－08

2015－11－04

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費項目（201203065）；國家重大科技成果轉(zhuǎn)化項目（ZD－2012－345－2）；國家科技基礎(chǔ)條件平臺項目

黃曉榮（1978－），女，博士，副研究員，從事魚類生理及低溫生物學(xué)研究。E-mail：hxr828＠126.com

莊 平，研究員。E-mail：pzhuang＠ecsf.ac.cn