石曉靜，孫劍玥，邱艷艷，鄒瑜，袁玉霞，賀 雪，張祎稀，唐雪瑤，殷佩浩上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062

·論 著·

蟾毒靈對人結(jié)腸癌HCT8細胞凋亡及鈣離子代謝的影響

石曉靜，孫劍玥，邱艷艷，鄒瑜，袁玉霞，賀 雪，張祎稀，唐雪瑤，殷佩浩
上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062

目的探討蟾毒靈對人腸癌HCT8細胞凋亡及鈣離子代謝的影響及其機制。方法采用CCK-8法和Annexin V/PI雙染凋亡試劑盒檢測蟾毒靈對人腸癌HCT8細胞增殖和凋亡的影響，Ca2+熒光探針Fluo-3 AM標(biāo)記HCT8細胞內(nèi)Ca2+并檢測蟾毒靈對細胞內(nèi)Ca2+的影響。結(jié)果蟾毒靈抑制人結(jié)腸癌HCT8細胞增殖呈劑量-時間依賴性；誘導(dǎo)細胞凋亡，呈劑量依賴性；且蟾毒靈濃度越高，細胞內(nèi)Ca2+濃度越高。結(jié)論蟾毒靈誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT8細胞凋亡，可能與細胞內(nèi)Ca2+代謝相關(guān)。

結(jié)腸癌；蟾毒靈；凋亡；鈣離子

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在美國發(fā)病率和死亡率均位居第三[1]，且逐年上升，我國發(fā)病率和死亡率分別是20.9/100 000、10.05/100 000[2]。目前最有效的治療方法是手術(shù)輔以放、化療。而中醫(yī)藥治療可明顯改善患者化療不良反應(yīng)[3-5]。

蟾毒靈提取自中藥蟾酥，是其主要的有效成分。本課題組對蟾毒靈抗結(jié)腸癌及其機制的多年研究表明，蟾毒靈可誘導(dǎo)癌細胞凋亡，是抗癌的重要物質(zhì)之一[6-9]，但蟾毒靈誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT8細胞凋亡與細胞內(nèi)Ca2+代謝的相關(guān)性，迄今未有定論。本研究旨在探討蟾毒靈對人結(jié)腸癌HCT8細胞凋亡、Ca2+代謝的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人結(jié)腸癌HCT8細胞購買于中國科學(xué)院上海細胞庫；蟾毒靈購自于成都瑞芬思生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自東京同仁化學(xué)有限公司；Annexin V/PI雙染凋亡試劑盒和流式細胞儀購自于BD公司；Ca2+熒光探針購自Sigma公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青霉素、鏈霉素購自Gibco公司；多功能熒光酶標(biāo)儀購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)技術(shù)

將細胞置于含有1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）的培養(yǎng)瓶中，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞用含EDTA的胰蛋白酶消化，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞增殖測定

取密度為5×104個/mL的細胞均勻鋪于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后分別加入2.5、10、20、40、80、160、320、640、1 280 nmol/L蟾毒靈作用24 h，再取80 nmol/L蟾毒靈分別于3、6、12、24、48 h處理細胞后，吸棄培養(yǎng)基，加入含10%CCK-8工作液的培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。運用多功能熒光酶標(biāo)儀檢測細胞光密度值（450 nm）。

1.2.3 Annexin V/PI雙染凋亡檢測

取密度為5×104個/mL的細胞均勻鋪于6孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)。隔日分別加入2.5、10、20、40、80、160、320、640、1 280 nmol/L蟾毒靈處理24 h。收集上清，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2遍，胰酶消化，收集細胞，1 500 r/min離心5 min，PBS重懸，再離心，重復(fù)2遍，用1×Binding Buffer重懸，取密度為1×105個/mL細胞100 μL至流式管中，分別加入5 μL的Annexin V/PI，室溫避光震蕩15～20 min，后每管再加入200 μL 1×Binding Buffer，混勻，流式細胞儀檢測。

1.2.4 Ca2+熒光探針Fluo-3 AM標(biāo)記細胞內(nèi)Ca2+

將細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分別用0、80、160、320、640、1 280 nmol/L蟾毒靈處理24 h，然后加入2 μmol/L Fluo-3 AM于37℃、5%CO2條件下孵育30 min，PBS清洗2遍，胰酶消化并收集細胞，1 500 r/min離心5 min，Ca2+-free PBS重懸，再離心，500 μL Ca2+-free PBS重懸細胞后用流式細胞儀（FL-1，Ex=488 nm，Em=530 nm）檢測細胞內(nèi)游離Ca2+變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 蟾毒靈對人結(jié)腸癌HCT8細胞增殖的影響

如圖1所示，蟾毒靈作用于HCT8細胞24 h，隨濃度遞增其抑制細胞增殖的作用增強，呈劑量依賴性，IC50約80 nmol/L；用80 nmol/L蟾毒靈作用于HCT8細胞，隨時間延長其抑制細胞增殖的作用增強，呈時間依賴性。

圖1 蟾毒靈對人結(jié)腸癌HCT8細胞增殖的影響Fig.1 Effects of bufalin on proliferation of colorectal cancer HCT8 cells

2.2 蟾毒靈誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT8細胞凋亡

如圖2所示，蟾毒靈作用于HCT8細胞24 h，隨濃度增高蟾毒靈誘導(dǎo)細胞凋亡率逐漸增高，亦呈劑量依賴性。

2.3 蟾毒靈致人結(jié)腸癌HCT8細胞Ca2+內(nèi)流

如圖3所示，蟾毒靈作用于HCT8細胞24 h，隨濃度增加蟾毒靈使胞內(nèi)Ca2+濃度增加，即Ca2+內(nèi)流情況加重。

3 討論

針對結(jié)腸癌的治療，目前臨床最常見的方法是手術(shù)切除，并輔以放療、化療、生物治療、中醫(yī)藥治療等綜合治療，延長患者生存期。但術(shù)后并發(fā)癥和放、化療的不良反應(yīng)嚴重影響患者的生存質(zhì)量。大量研究表明，中藥在抑制結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展上具有顯著療效[3-5]。在抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、增強放化療敏感性和改善患者癥狀等方面發(fā)揮重要作用。其中，蟾毒靈具有一定的細胞毒性，抗癌作用已取得一定進展，包括誘導(dǎo)癌細胞凋亡、分化，抑制增殖，增強放、化療敏感性等，但具體機制尚不明確。誘導(dǎo)癌細胞凋亡是治療癌癥的重要方向之一。研究表明，蟾毒靈能誘導(dǎo)癌細胞凋亡[11-15]，但凋亡機制尚不明確。本研究初步探索了蟾毒靈對人結(jié)腸癌HCT8細胞凋亡和Ca2+代謝的影響及其可能的機制。

圖2 蟾毒靈對人結(jié)腸癌HCT8細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of bufalin on apoptosis of colorectal cancer HCT8 cells

圖3 蟾毒靈對人結(jié)腸癌HCT8細胞Ca2+內(nèi)流的影響Fig.3 Effects of bufalin on intracellular Ca2+in colorectal cancer HCT8 cells

細胞凋亡是機體的一種主動、程序化的過程，受體內(nèi)多種因素調(diào)節(jié)，是細胞衰老、死亡過程的主要形式。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體間的鈣通路是細胞凋亡的一個重要環(huán)節(jié)。有研究表明，Ca2+通道抑制劑對多種腫瘤細胞表現(xiàn)出抗癌活性，且在臨床上已作為抗腫瘤化療的輔助用藥[16]。Ca2+通透性通道主要包括電壓門控鈣通道（voltage-gated calcium channels，VGCC）、配體門控鈣通道（ligand-gated calcium channels，LGCC）、瞬時感受器電位（transient receptor potential，TRP）、鈣庫調(diào)控的鈣通道[17]（store-operated calcium channels，SOCs）和花生四烯酸調(diào)控的鈣通道（arachidonate-regulated Ca2+entry channel，ARC）[18]等。細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加主要來源于細胞外Ca2+內(nèi)流和細胞內(nèi)鈣源的釋放。鈣的內(nèi)流和釋放被細胞各種調(diào)控系統(tǒng)精密控制。在人類SPC-A1肺腺癌細胞株中，通過L型鈣通道的鈣內(nèi)流被證實與內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）有關(guān)而促進腫瘤增殖[19]。在乳腺癌細胞株MCF-7中TRPM7基因沉默后，細胞內(nèi)基礎(chǔ)Ca2+濃度和細胞增殖減少，提示TRPM7可能通過調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流而參與乳腺癌細胞凋亡[20]。激素耐受且凋亡拮抗的前列腺癌細胞表型鈣庫操作性Ca2+通道（store-operated Ca2+entry，SOCE）水平明顯降低[21]，從而阻止促凋亡刺激引起的鈣過載，降低了線粒體和細胞質(zhì)的凋亡通路活性。鈣通透性通道和鈣依賴信號對腫瘤血管生成起重要作用[22]?？梢?，細胞內(nèi)Ca2+變化不僅與凋亡相關(guān)，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究表明，蟾毒靈誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT8細胞凋亡，可能與細胞內(nèi)Ca2+代謝相關(guān)。Ca2+在體內(nèi)代謝是一個較為復(fù)雜的過程。蟾毒靈誘導(dǎo)HCT8細胞凋亡與Ca2+代謝具體作用機制，關(guān)鍵的作用靶點，有待進一步研究。

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Preliminary study of effects of bufalin on apoptosis and calcium metabolism in human colorectal cancer HCT8 cells

SHI Xiaojing，SUN Jianyue，QIU Yanyan，ZOU Yu，YUAN Yuxia，HE Xue，ZHANG Yixi，TANG Xueyao，YIN Peihao
Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China

ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of bufalin on apoptosis and calcium metabolism in human colorectal cancer HCT8 cells.MethodsCCK-8 method and Annexin V/PI double staining were used to detect the effects of bufalin on proliferation and apoptosis of human colorectal cancer HCT8 cells，respectively.Ca2+fluorescence probe Fluo-3 AM marker was adopted to investigate the effects of bufalin on intracellular Ca2+of HCT8 cells.ResultsBufalin inhibited the proliferation of HCT8 cells in dose-and time-dependent manners，and induced the apoptosis of HCT8 cells in a dose-dependent manner.A higher concentration of intracellular Ca2+was observed when cells were treated by a higher concentration of bufalin.ConclusionBufalin can induce apoptosis of human colorectal cancer HCT8 cells，and its mechanism may be related to the metabolism of intracellular Ca2+.

Colorectal cancer；Bufalin；Apoptosis；Ca2+

R735.3

A

2095-378X（2016）04-0225-04

10.3969/j.issn.2095-378X.2016.04.001

2016-09-30）

國家自然科學(xué)基金（81473482，81603464）；國家中醫(yī)藥管理局“十二五”中醫(yī)藥重點學(xué)科（中西醫(yī)結(jié)合臨床）；上海市科委2016年度醫(yī)學(xué)引導(dǎo)類（中、西醫(yī)）科技支撐項目（16411972600）

石曉靜（1990—），女，住院醫(yī)師，碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合防治胃腸腫瘤的臨床研究

殷佩浩，電子信箱：yinpeihao1975@hotmail.com