李玲，謝明水，劉楊，張秋瑩

(湖北醫(yī)藥學院附屬隨州醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，湖北 隨州 441300)

HPV感染及DAPK甲基化與宮頸病變的相關性研究

李玲，謝明水，劉楊，張秋瑩

(湖北醫(yī)藥學院附屬隨州醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，湖北 隨州 441300)

目的研究人乳頭瘤病毒(HPV)感染及死亡相關蛋白激酶(DAPK)甲基化與宮頸病變的相關性。方法選擇2012年6月至2015年6月在我院接受診治的310例疑似宮頸病變患者作為研究對象。依照陰道鏡的宮頸活檢結果進行分組，主要包含宮頸上皮內瘤變Ⅰ～Ⅲ級(CINⅠ～Ⅲ)186例，鱗狀細胞癌(SCC)36例，以及未發(fā)現(xiàn)惡性細胞及上皮內病變細胞(NILM)88例。檢測并對比各組受試者不同宮頸病變對應的HPV感染情況、DAPK甲基化率，分析二者與宮頸病變的相關性。結果310例不同的宮頸病變患者中，共檢出212例高危HPV感染陽性者，陽性率為68.39%；伴隨宮頸病變程度進展，高危HPV感染陽性率亦表現(xiàn)為增高趨勢[NILM：31.82%(28/88)；CINⅠ：69.51%(57/82)；CINⅡ：85.25%(52/61)；CINⅢ：90.70%(39/43)；SCC：100.00%(36/36)]，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；59例DAPK甲基化陽性者，甲基化率為19.03%；伴隨宮頸病變程度進展，宮頸組織DAPK基因甲基化率亦表現(xiàn)為增高趨勢[NILM：3.41%(3/88)；CINⅠ：9.76%(8/82)；CINⅡ：13.11%(8/61)；CINⅢ：44.19%(19/43)；SCC：58.33%(21/36)]，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。根據Pearson法分析相關性可知，HPV感染與DAPK甲基化及宮頸病變均呈正相關(P＜0.05)，DAPK甲基化與宮頸病變亦呈正相關(P＜0.05)。結論HPV感染及DAPK甲基化均與宮頸病變具有緊密聯(lián)系，臨床診斷與治療時均可對其進行持續(xù)監(jiān)測，值得關注。

HPV感染；DAPK甲基化；宮頸病變；相關性

宮頸癌是一種嚴重危害女性身體健康的惡性疾病，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第二位。目前研究表明，宮頸癌是由宮頸上皮內瘤變逐步發(fā)展形成。在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展中人乳頭瘤病毒(HPV)感染起到重要作用[1-2]。有報道顯示，HPV感染女性宮頸癌發(fā)病率顯著升高[3]。除此之外抑癌基因失活和甲基化在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展中也起到了重要作用。其中死亡相關蛋白激酶(DAPK)基因是一種凋亡正相性調節(jié)因子，當其失活時，細胞程序性的死亡過程被阻斷，致使細胞壽命增長，誘使腫瘤發(fā)生。對于正常的宮頸組織，基因啟動子有關區(qū)域含有的CpG島處在非甲基化亦或是低甲基化的狀態(tài)，但在惡性宮頸病變組織中，CpG島甲基化情況明顯增加，與之有關的基因表達亦隨之缺失[4]。本文通過分析HPV感染及DAPK甲基化與宮頸病變的相關性，旨在為臨床診治宮頸病變提供理論數據支持，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6月至2015年6月在我院接受診治的310例疑似宮頸病變患者作為研究對象。所有患者均實施TCT及陰道鏡檢查，年齡30～55歲，平均年齡(42.5±2.3)歲。依照陰道鏡的宮頸活檢結果進行分組，主要包含宮頸上皮內瘤變CINⅠ級82例，CINⅡ級61例、CINⅢ級43例，鱗狀細胞癌(SCC)36例，以及未發(fā)現(xiàn)惡性細胞及上皮內病變細胞(NILM)88例。排除標準：(1)有其他類型的惡性腫瘤者；(2)提取標本前接受過放、化療或者手術治療者。本次研究涉及的相關檢測均已獲得患者同意，并由醫(yī)院倫理委員會會議審批后批準。

1.2 研究方法

1.2.1 HPV-DNA檢測 將已制好的細胞保存液進行混勻，并吸取1 mL的細胞懸液，放置在1.5 mL的離心管內，離心5 min，棄去上清液。往細胞沉淀內加進1 mL的細胞洗滌劑(Cell Washing Solution)，再將細胞沉淀行充分懸浮，離心5 min，棄去上清液。再加進200 μL的Fast Extract Solution，進行搖動或者渦旋振蕩，再充分懸浮得到的細胞沉淀。實施15 min的95℃水浴或者金屬浴，每5 min搖勻1次。離心3 min，將上清用作PCR擴增，在-20℃下保存剩余的基因組，若再次使用，則需融化搖勻并離心3 min。利用紫外分光光度儀檢測提取DNA分別在260 nm、280 nm、320 nm時的吸光度(OD)，DNA濃度為(OD260-OD320)×稀釋倍數×0.05 μg/μL。將擴增混合液及Taq酶以89:1的比例配成PCR反應體系，總量100 μL。依據標記，朝各PCR管內加進10 μL對應樣本DNA亦或是陽性對照流池內控品?；靹?、離心，使液體收集于PCR管底部。已配制好的PCR擴增體系置入PCR擴增儀內，依照下列程序設置好擴增條件：(1)50℃2 min，94℃4 min；(2)94℃30 s，48℃45 s，72℃20 s，28個循環(huán)；(3)94℃30 s，65℃45 s，72℃20 s，25個循環(huán)；(4)4℃保存。擴增完成后實施檢測。

1.2.2 DAPK甲基化檢測 進行DNA變性處理，DAPK基因引物設計：M：正義鏈：5'-GGATAGTCGGAT CGAGTTAACGTC-3'，反義鏈：5'-CCCTCCCAAACGC CGA-3'，產物大小為98 bp。U：正義鏈：5'-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3'；反義鏈：5'-CA

AATCCCTCCCAAACACCAA-3'，產物大小為106 bp。進行甲基化專一性PCR操作，經過上樣和電泳、固定、銀染、顯影及定影處理后判斷甲基化結果。

1.3 觀察指標 對比不同宮頸病變對應的HPV感染情況，DAPK甲基化率，分析二者與宮頸病變的相關性。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計數數據比較采用χ2檢驗，應用Pearson相關分析進行數據相關分析檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同宮頸病變對應的HPV感染情況對比 310例不同的宮頸病變患者中，共檢出212例高危HPV感染陽性者，陽性率為68.39%。伴隨宮頸病變程度進展，高危HPV感染陽性率亦表現(xiàn)為增高趨勢，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=89.043，P=0.000)，見表1。

表1 不同宮頸病變對應的HPV感染情況對比[例(%)]

2.2 不同宮頸病變的DAPK甲基化率對比 310例不同的宮頸病變患者中，共檢出59例DAPK甲基化陽性者，甲基化率為19.03%。伴隨宮頸病變程度進展，宮頸組織DAPK基因甲基化率亦表現(xiàn)為增高趨勢，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=73.642，P=0.000)，見表2。

表2 不同宮頸病變的DAPK甲基化率比較[例(%)]

2.3 HPV感染及DAPK甲基化與宮頸病變的相關性 根據Pearson法分析相關性可知，HPV感染與DAPK甲基化及宮頸病變均呈正相關，DAPK甲基化與宮頸病變亦呈正相關(P＜0.05)，見表3。

表3 HPV感染及DAPK甲基化與宮頸病變的相關性

3 討 論

近年來發(fā)現(xiàn)，女性的宮頸病變的主要原因包括HPV感染、性生活活躍以及性傳播疾病等多種因素，患者通常會經歷CINⅠ～Ⅲ以及原位癌和宮頸浸潤癌等諸多階段[5]。但不是所有的宮頸病變患者均存在HPV感染，而HPV感染者也不一定發(fā)生宮頸病變。因此宮頸病變過程中還伴有其他因素的改變，其中抑癌基因失活和異常甲基化起到重要作用。DAPK時定位于9q34.1的一種鈣調節(jié)蛋白依賴性激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，也是細胞凋亡的重要基因。當DAPK基因的異常甲基化，可導致其表達產物缺失，細胞凋亡受阻，利于腫瘤細胞的增殖[6]。因此，分析HPV感染及DAPK甲基化與宮頸病變之間的聯(lián)系對于患者宮頸病變的監(jiān)測診斷具有重要作用。Yang等[7]通過對85例宮頸癌標本的研究發(fā)現(xiàn)80%宮頸癌標本存在DAPK甲基化，并認為，DAPK甲基化對于宮頸病變起到重要作用。

本研究通過研究分析后發(fā)現(xiàn)，310例不同的宮頸病變患者中，高危HPV感染的陽性率為68.39%，甲基化率為19.03%，低于Yang等[7]的報道，其原因主要是本研究選擇病例為疑似宮頸病變，含有NILM和CIN者，因此DAPK甲基化率和HPV感染的陽性率較低。且根據Pearson法分析相關性可知，HPV感染與DAPK甲基化及宮頸病變均呈正相關，DAPK甲基化與宮頸病變亦呈正相關，提示在宮頸病變程度逐漸加重的患者群體中，HPV感染以及DAPK甲基化的癥狀均明顯增加。符合Kietpeerakool等[8]的相關報道結果。究其原因，筆者認為這主要與以下兩個方面的原因有關：在HPV感染方面，當前使用的測定技術可對HPV-DNA實施準確分型，HPV存在120多種亞型，其中6、11及42～44等亞型為低危型，通常不會誘發(fā)癌變，可引起CINⅠ等病變；而16、18及31等亞型為高危型，可誘發(fā)CINⅡ～Ⅲ型病變及宮頸癌。因此，對于宮頸病變程度逐漸加重的患者類別，HPV檢測陽性率亦隨之增高，從而準確地反映出癌前病變及宮頸癌。在DAPK甲基化方面，抑癌基因DAPK作為Ca2+鈣調素依賴激酶，其可導致底物蛋白具有的絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生殘基磷酸化。Chagas等[9]報道指出，DAPK表達水平的降低和多類腫瘤的進展及轉移均密切相關。DAPK在各類細胞凋亡的信號通路中均可廣泛存在，甚至在細胞凋亡初期即已被激活，活性亦能夠持續(xù)到不可逆自毀時。DAPK甲基化可導致表達缺失，患者機體穩(wěn)態(tài)失去平衡，細胞生長周期隨之延長，并使腫瘤細胞發(fā)生無限增殖，因此宮頸病變的癥狀更加嚴重。因此，宮頸病變程度越重的患者發(fā)生DAPK甲基化的幾率亦越大。劉曉婉等[10]報道稱，DAPK基因的啟動子區(qū)CpG島發(fā)生的異常甲基化可能是導致此基因表達發(fā)生丟失的一個主要原因，而正常的宮頸鱗狀上皮組織中一般不會發(fā)生此種甲基化狀況。此外，在Wang等[11]和花敏慧等[12]的報道中亦可發(fā)現(xiàn)類似的結果。

綜上所述，HPV感染及DAPK甲基化均與宮頸病變具有緊密聯(lián)系，臨床診斷與治療時均可對其進行持續(xù)監(jiān)測，值得關注。

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Correlation analysis of HPV infection and DAPK methylation with cervical lesions.

LI Ling,XIE Ming-shui,LIU Yang,ZHANG Qiu-ying.Department of Clinical Laboratory,Suizhou Hospital Affiliated to Hubei Medical College,Suizhou 441300,Hubei,CHINA

ObjectiveTo study the correlation of human papillomavirus(HPV)infection and death-associated protein kinase(DAPK)methylation with cervical lesions.MethodsA total of 310 cases of patients with suspected cervical lesion,who admitted to our hospital from June 2012 to June 2015,were chosen as the research objects.According to the results of cervical biopsy of the cervix,these patients were divided into CIN group[186 cases of cervical intraepithelial neoplasia 1～3(CIN 1～3)],SCC group[36 cases of squamous cell carcinoma(SCC)],and NILM group[88 cases of malignant cells and intraepithelial lesions(NILM)].HPV infection statuses of different cervical lesions and DAPK methylation rate were compared,and the correlations of HPV infection and DAPK methylation with cervical lesions were analyzed.ResultsOf 310 cases of cervical lesions,212 cases of high risk HPV infection were identified,and the positive rate was 68.39%.With the progress of cervical lesions,the positive rate of high risk HPV infection also showed an increasing trend[NILM:31.82%(28/88);CIN-Ⅰ:69.51%(57/82);CIN-Ⅱ:85.25%(52/61);CIN-Ⅲ90.70%(39/ 43);SCC:100.00%(36/36)],and the differences between groups were statistically significant(P＜0.05).The methylation rate(59 cases with DAPK methylation)was 19.03%.Along with the progress of cervical lesions,the DAPK gene methylation rate of cervical tissue also showed an increasing trend[NILM:3.41%(3/88);CIN-Ⅰ:9.76%(8/82);CIN-Ⅱ: 13.11%(8/61);CIN-Ⅲ:44.19%(19/43);SCC:58.33%(21/36)],and the differences between groups were statistically significant(P＜0.05).Basing on the analysis of Pearson correlation,HPV infection was positively correlated with DAPK methylation and cervical lesions,and DAPK methylation was positively correlated with cervical lesions(P＜0.05).ConclusionHPV infection and DAPK methylation were closely associated with cervical lesions,which deserve to be monitored in the clinical diagnosis and treatment.

HPV infection;DAPK methylation;Cervical lesions;Correlation

R730.261

A

1003—6350（2016）10—1622—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.025

2015-08-26)

李玲。E-mail：hbsszsli@sina.com