周曉冬，錢宏波，劉會利，白妙，趙漢東，劉紅莉

(西安市第八醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710061)

不同臨床類型肝病患者血清中自身抗體的檢測及臨床應(yīng)用

周曉冬，錢宏波，劉會利，白妙，趙漢東，劉紅莉

(西安市第八醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710061)

目的 分析不同臨床類型肝病患者血清中各種自身抗體的存在狀況，探討其臨床應(yīng)用價值。方法采用間接免疫熒光法和免疫印跡法，對我院2010年6月至2014年2月3 124例不同類型肝病患者和200例正常健康體檢者血清中的抗核抗體(ANA)、抗線粒體抗體(AMA)、抗平滑肌抗體(ASMA)、抗肝腎微粒體抗體(LKM)和自身免疫肝病譜等9項指標(biāo)進行檢測。結(jié)果病毒性肝炎ANA、AMA陽性率分別為11.11%、0.39%，抗肝抗原自身抗體檢測陽性率分別為AMA M22.22%，M2-3E 1.86%、Sp100 0.59%、PML 0.42%、gp210 3.81%、LKM-1 0.62%、LC-1 2.28%、SLA-LP 0.26%、Ro52 10.6%。自身免疫性肝病ANA、AMA陽性率分別為90.63%、78.13%,抗肝抗原自身抗體檢測陽性率分別依次為71.87%，71.87%、6.25%、6.25%、65.63%、3.13%、0、21.88%、93.75%。與病毒性肝炎比較，自身免疫肝病的9項指標(biāo)以及ANA、AMA的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與正常對照組比較，丙肝、自身免疫肝病、藥物性肝炎的ANA陽性率的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。甲肝、戊肝、脂肪肝血清中未檢測出自身抗體。與病毒性肝炎比較，藥物性肝炎的ANA檢出率差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。各型肝炎患者ANA的熒光模型存在差異。結(jié)論檢測自身抗體的類型、滴度以及熒光模型對于不同類型肝病的診斷和治療具有臨床參考價值。

病毒性肝炎；抗核抗體；自身免疫肝病；自身抗體；臨床應(yīng)用

自身抗體是指針對自身組織、器官、細(xì)胞及細(xì)胞成分的抗體。正常人體血液中存在低滴度的生理性自身抗體，不引發(fā)疾病，當(dāng)其滴度升高到一定水平，機體的免疫耐受平衡被破壞，引起組織臟器受損，導(dǎo)致自身免疫疾病發(fā)生。我國是慢性肝炎的高發(fā)區(qū)，自1970年首次報道某些結(jié)接性多動脈炎患者與乙肝病毒感染相關(guān)后肝炎病毒與自身免疫的相關(guān)性得到關(guān)注，病毒性肝炎的發(fā)生和發(fā)展可能涉及對自身抗原的免疫應(yīng)答，包括自身抗體應(yīng)答和自身反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答。因此了解不同類型肝炎患者自身抗體的狀況，有利于臨床合理用藥，也利于和自身免疫性肝病的鑒別。為探討各類肝病患者血清中自身抗體的存在狀況和臨床應(yīng)用價值，我們檢測并統(tǒng)計了3 124例不同肝病患者的多項自身抗體，現(xiàn)將檢測分析結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 3 124例患者均來自2010年6月至2014年2月西安市第八醫(yī)院的住院患者，男性2 035例，年齡11～74歲；女性1 089例，年齡17～77歲；其中病毒性肝炎3067例(包括乙肝2 120例，丙肝928例，乙丙肝11例，戊肝5例，甲肝3例)、自身免疫性肝病32例、藥物性肝炎17例以及脂肪肝8例。所有入選的確診病例中病毒性肝炎的診斷，符合2000年《病毒性肝炎防治方案》，排除其他自身免疫性疾病；自身免疫肝病的診斷，參照國際自身免疫肝病小組修訂的評分標(biāo)準(zhǔn)。以200例各型肝炎血清標(biāo)志物陰性，并且肝功能正常的健康體檢者作為正常對照組，其中男性107例，女性93例，年齡16～46歲。

1.2 研究方法

1.2.1 間接免疫熒光法(Indirect immunofluo rescence,IIF)：采集患者靜脈血液，分離血清。用德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份有限公司生產(chǎn)的肝臟馬賽克4進行檢測。該試劑盒包被有4種抗原基質(zhì)：Hep-2、猴肝、大鼠胃、大鼠腎臟?？蓹z測抗核抗體(Anti-nuclear antibody，ANA)、抗平滑肌抗體(Anti-smooth muscle antibody，ASMA)、抗線粒體抗體(Anti-mitochondrial antibody，AMA)、抗肝腎微粒體抗體(Liver kidney microsomal antibody，LKM)。按試劑盒要求操作，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞或組織內(nèi)出現(xiàn)特異性綠色熒光，血清稀釋度大于等于1:100判為陽性。

1.2.2 免疫印跡法 采用歐蒙肝抗原譜9項試劑條檢測血清中自身抗體，包括丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(AMA M2)、BPO線粒體內(nèi)膜α-2酮酸脫氫酶E-2亞基的融合蛋白(M2-3E)、核顆粒蛋白(Sp100)、早幼粒細(xì)胞白血病蛋白(PML)、核膜整合蛋白(gp210)、肝腎微?？贵wⅠ型(LKM-1)、肝細(xì)胞溶質(zhì)抗原Ⅰ型(LC-1)、可溶性肝抗原(SLA/LP)、Ro52等自身抗體。血清按照1:100稀釋，全部操作按照試劑盒步驟，用歐蒙公司的計算機程序(EURO Line Scan)自動判讀條帶的陰陽性和著色強度。

1.2.3 ANA和AMA的結(jié)果判定 在熒光顯微鏡下ANA陽性時Hep-2細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞膜上出現(xiàn)各種不同的熒光，并結(jié)合猴肝上相應(yīng)的熒光判定；AMA陽性時Hep-2細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)顆粒狀熒光、大鼠腎近曲小管和遠(yuǎn)曲小管均有明顯的熒光、大鼠胃壁細(xì)胞呈明顯熒光、猴肝細(xì)胞質(zhì)上呈細(xì)沙狀熒光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，各項檢測結(jié)果陽性率以百分率表示，單項陽性率間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各類肝病患者的ANA、AMA、ASMA、LKM檢測結(jié)果 乙肝、丙肝、乙丙肝、自免肝病、藥物性肝炎的ANA陽性率分別為9.39%、15.08%、18.18%、90.63%、29.41%，乙肝比對照組高5.39%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；丙肝、乙丙肝、自免肝病、藥物性肝炎與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；自免肝病、藥物性肝炎與病毒肝炎組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；乙、丙肝ANA以低滴度(1:100)為主，自免肝病、藥物性肝炎、乙丙肝ANA以高滴度(≥1:320)為主。自身免疫性肝病AMA陽性率為78.13%(≥1:320)，與乙肝、丙肝的AMA陽性率0.09%、1.08%比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。乙肝、丙肝、自免肝病ASMA陽性率分別為0.05%、0.43%、3.12%。乙肝、自免肝病LKM陽性率分別為0.05%、3.12%。甲肝、戊肝及脂肪肝中未檢測出自身抗體，見表1。

表1 3 124例肝病患者自身抗體熒光檢測結(jié)果[例(%)]

2.2 不同臨床類型肝病患者肝抗原譜9項的檢測結(jié)果 乙肝、丙肝的患者血清中9種肝抗原譜抗體呈現(xiàn)不同的陽性率；甲肝、戊肝、脂肪肝患者均未檢測到任何自身抗體；自身免疫性肝病患者的AMAM2(78.13%)、M2-3E(78.13%)、gp210(65.63%)、SLA/LP (21.88%)、Ro52(93.75%)顯著高于對照組和病毒性肝炎組(P＜0.01)；藥物性肝炎患者AMAM2(23.53%)、gp210(11.76%)、Ro52(17.65%)明顯高于對照組；乙丙肝患者AMAM2(18.18%)、M2-3E(18.18%)、gp210 (18.18%)，見表2。

2.3 各類肝炎ANA和AMA熒光模型分析 乙肝的ANA熒光模型以均質(zhì)型、核顆粒型、核仁型為主。丙肝的ANA熒光模型以均質(zhì)型、核顆粒型、胞漿顆粒型為主。藥物性肝炎的核型為胞漿顆粒型、核仁型和核顆粒型。乙丙肝有核顆粒型和核仁型兩種。乙肝、丙肝、自身免疫肝病中可見混合核型。自身免疫性肝病的ANA熒光模型有胞漿顆粒型、核點型、著絲點型、核顆粒型、核仁型、均質(zhì)型和胞漿纖維型，AMA陽性時的ANA的熒光模型有胞漿顆粒性、核點型和著絲點型，見表3。

表2 3 124例肝病患者肝抗原抗體檢測結(jié)果[例(%)]

表3 378例ANA陽性的熒光模型分析[例(%)]

2.4 32例自身免疫性肝病分型 25例原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)表現(xiàn)為ANA陽性(胞漿顆粒型、著絲點型、核點型)、AMA陽性(基質(zhì)大鼠腎和大鼠胃細(xì)胞線粒體呈顆粒狀熒光)、AMAM2、M2-3E 2、gp210、Ro52均強陽性；5例自身免疫性肝炎(AIH)Ⅲ型有2例表現(xiàn)為ANA陽性(核顆粒型、核仁型)、SLA/LP強陽性；1例AIHⅡ型ANA陽性(胞漿顆粒型)、LKM陽性(基質(zhì)大鼠腎細(xì)胞線粒體或陰或陽)、LKM-1強陽性；1例AIHⅠ型ANA陽性(胞漿纖維型)、ASMA陽性(基質(zhì)大鼠胃腺體間收縮纖維呈條索狀熒光)。

3 討 論

自身抗體是指各種原因造成的機體B細(xì)胞產(chǎn)生針對自身組織的抗體，也是一類受自身和外界影響不斷變化的抗體，高滴度的自身抗體可導(dǎo)致機體一系列生理和病理改變。本研究通過對不同類型肝炎的自身抗體分析表明病毒、藥物對自身抗體的影響與正常對照有顯著差異，自身免疫性肝病中特異性的自身抗體與病毒性肝炎之間有明顯差異。

3 124例肝病中約98%屬于病毒性肝炎，肝炎病毒感染主要通過機體對病毒的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致肝細(xì)胞的損害[1]，其可以直接破壞肝細(xì)胞，也能引起靶細(xì)胞中的抗原成分改變或者由于病毒蛋白與正常組織成分間有同源性可誘發(fā)自身免疫，HCV感染通過分子模擬現(xiàn)象激活自身反應(yīng)性CD8陽性T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生自身免疫現(xiàn)象[2]。Michalska等[3]研究認(rèn)為，HBV和HCV感染者體內(nèi)可產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答并出現(xiàn)多種自身抗體，自身抗體的出現(xiàn)不僅與病毒感染有關(guān)，而且與病毒感染的嚴(yán)重程度、病程長短密切相關(guān)[4]。有文獻報道HBV患者ANA陽性率為13.7%，HCV患者ANA陽性率為15.7%[5]，HAV感染后也可誘發(fā)自身免疫性肝臟疾病[6]。本研究證明：HBV、HCV組ANA檢出率分別為9.4%、15.1%，乙肝與上述報道稍有差異，丙肝感染相對乙肝容易誘發(fā)自身抗體。乙丙肝混合感染11例并不多見，但ANA中有2例(18.18%)陽性并呈高滴度(≥1:320)，說明肝炎病毒混合感染更容易破壞自身免疫系統(tǒng)，治療上應(yīng)引起重視。藥物性肝炎17例5例(29.41%)ANA呈高滴度陽性，而且血清中存在的肝抗原抗體AMAM2、3E、Ro52，說明藥物或/及其代謝產(chǎn)物不光引起的肝臟炎癥性損害，也會引起自身免疫系統(tǒng)的改變，提示臨床在用藥過程中及時檢測肝功能和自身抗體的變化。HAV和HEV患者中未檢出自身抗體，可能與我們收集的甲肝、戊肝病例少或地域有關(guān)。脂肪肝是因肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積引起的肝臟病變，故未影響自身免疫系統(tǒng)。

自身免疫性肝病組的ANA檢出率為90.63%，明顯高于病毒性肝炎組11.11%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。自身免疫性肝病29例ANA滴度全部(100%)為高滴度(≥1:320)，而HBV和HCV中ANA高滴度(≥1:320)僅有22例(1.04%)和19例(2.05%)，說明HBV和HCV感染者ANA滴度以低滴度(1:100)為主。一般認(rèn)為自身免疫疾病的啟動因子是病毒感染，而乙、丙肝中高滴度的自身抗體與自身免疫性疾病密切相關(guān)，病毒性肝炎患者在發(fā)病和治療中是否伴有自身免疫現(xiàn)象或誘導(dǎo)產(chǎn)生自身免疫性疾病，這是一個長期動態(tài)的變化過程。病毒性肝炎患者在用干擾素抗病毒治療過程中，藥物可誘導(dǎo)或增強自身免疫，若對存在高滴度自身抗體的乙、丙型肝炎患者繼續(xù)干擾素治療，可能會誘導(dǎo)或增強自身免疫活性細(xì)胞，加重自身免疫性反應(yīng)[7]，故慢性病毒性肝炎在使用干擾素抗病毒治療前必須排除自身免疫性疾病，對伴有高滴度的自身抗體存在時，選擇治療方案要十分慎重，應(yīng)在保肝的基礎(chǔ)上進行抗病毒和免疫調(diào)節(jié)劑的治療。相反，自身免疫性肝病臨床常用激素等免疫抑制劑治療，但免疫抑制劑可抑制機體正常有益的免疫反應(yīng)，長期使用可導(dǎo)致機體抵抗力下降，誘發(fā)嚴(yán)重的感染、惡性腫瘤等疾病。所以，若兩類肝病診斷失誤，給予相反的治療將會加重病情[8]。因此，對各類肝病患者進行自身抗體及滴度的監(jiān)測，對于病毒性肝炎和自身免疫性肝病的認(rèn)識和鑒別有一定的意義，并可進一步指導(dǎo)臨床合理用藥。

自身免疫性肝病是一種特殊類型的慢性肝病，肝組織的改變與慢性病毒性肝炎相一致，但伴有皮膚瘙癢、關(guān)節(jié)酸痛、內(nèi)分泌失調(diào)、低熱、干燥綜合征等肝外表現(xiàn)，發(fā)展為肝硬化的時間比病毒性肝炎短，不易治愈，血清中可發(fā)現(xiàn)與肝臟相關(guān)的循環(huán)自身抗體[8]，并呈強陽性。自身免疫性肝病患者的肝抗原相關(guān)抗體AMAM2、3E、gp210、SLA/LP、Ro52均呈強陽性，明顯高于病毒性肝炎組。線粒體抗體(AMA)陽性是診斷PBC的重要免疫學(xué)指標(biāo)，95%～98%的PBC患者AMA陽性，AMAM2抗體陽性見于90%的PBC[9]。本研究表明25例PBC患者AMA均陽性，其中23例(92%) AMAM2抗體陽性，與上述基本相符。據(jù)國內(nèi)報道，只要AMA抗體和AMAM2抗體陽性的患者，即使沒有臨床癥M2抗體陽性的患者應(yīng)引起重視，建議定期復(fù)查。

ANA熒光模型包括均質(zhì)型、胞漿顆粒型、核顆粒型、核點型、核膜型、著絲點型等。在本研究中，乙肝和丙肝ANA的熒光模型大多數(shù)呈低滴度，沒有明顯的鑒別意義，但自身免疫性肝病的ANA、AMA等熒光模型均為高滴度，可根據(jù)熒光模型和特異性肝抗原抗體來分型。國內(nèi)報道PBC患者AMA抗體陽性的核型分別為顆粒型59.3%，著絲點型22.2%，胞質(zhì)型18.5%[11]。也有國外報道PBC患者AMA抗體陽性的常見熒光模式為著絲點型、核膜型和核點型，其中核膜型AMA是PBC的一個特異性血清學(xué)指標(biāo)，它們的出現(xiàn)有助于PBC的診斷。本研究25例PBC中AMA的熒光模型為胞漿顆粒型88.0%、著絲點型8.0%、核點型4.0%，與上述報道均不相符，分析原因可能與患者的地域、種族和試劑不同、操作人員的差異有關(guān)。

綜上說述，不同類型的肝病患者血清中自身抗體呈不同程度的變化，動態(tài)的影響機體自身免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，定期檢測自身抗體能為臨床提供重要的診斷和鑒別診斷依據(jù)，使患者能夠得到及時合理化的治療。

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Detection and clinical application of autoantibodies in serum of patients with different type of hepatopathy.

ZHOU Xiao-dong,QIAN Hong-bo,LIU Hui-li,BAI Miao ZHAO Han-dong,LIU Hong-li.Department of Clinical Laboratory, Xi'an No.8 Hospital,Xi'an 710061,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate a series of autoantibodies expression in the serum of patients with different clinical types of hepatopathy,and their role in diagnosis and clinical application.MethodsRetrospective analysis was performed in 3 124 patients with different clinical types of hepatopathy and 200 healthy people undergoing health check,who admitted to our hospital from June 2010 to February 2014,to detect antinuclear antibody(ANA),antimitochondrial antibody(AMA),antismooth muscle antibody(ASMA),antiliver-kidney microsomes antibody(LKM),antiliver specific lipoprotein antibody(ALSP)and 9 indexes of antibody in autoimmune liver disease through indirect immunofluorescence and immunoblotting test.ResultsThe positive rates of ANA and AMA of viral hepatitis were respectively 11.11%and 0.39%.Meanwhile,the positive rates of AMA M2,M2-3E,SP100,PML,gp210,LKM-1,LC-1,SLA-LP and Ro50 were respectively 2.22%,1.86%,0.59%,0.42%,3.81%,0.62%,2.28%,0.26%and 10.6%.The positive rates of ANA and AMA of autoimmune liver disease were 90.63%and 78.13%,respectively.And then,the positive rates of AMA M2,M2-3E,SP100,PML,gp210,LKM-1,LC-1,SLA-LP and Ro50 were 71.87%,71.87%,6.25%,6.25%, 65.63%,3.13%,0,21.88%and 93.75%.The positive rates of ANA,AMA,and 9 indexes of antibody in autoimmune liver disease were significantly higher than that of viral hepatitis(P＜0.01).There were significant differences between patients with different clinical type of hepatopathy and healthy people in the positive rate of ANA in Hepatitis C,autoimmune liver disease,and drug-induced hepatitis(P＜0.01).All the autoantibodies were not detected in Hepatitis A,Hepatitis E,and Fatty liver.The positive rate of ANA in drug-induced hepatitis was significantly higher than that of viral hepatitis(P＜0.01).The fluorescence model of ANA was different among all types of hepatopathy.ConclusionThe detection of type,titer,and fluorescence model of autoantibodies in different type of hepatopathy is valuable for improving the diagnosis and therapy.

Viral hepatitis;Antinuclear antibody(ANA);Autoimmune liver disease;Autoantibody;Clinical application

R575

A

1003—6350（2016）10—1602—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.018

2015-09-15)

劉紅莉。E-mail：liuhongli@sina.com