饒翔，楊丞

(1.海口市人民醫(yī)院病理科，海南 ?？?570108；2.海南醫(yī)學院病理教研室，海南 ?？?571199)

HSP27、E-cadherin及Ki-67在星型膠質(zhì)細胞腫瘤中的表達及意義

饒翔1，楊丞2

(1.?？谑腥嗣襻t(yī)院病理科，海南 ?？?570108；2.海南醫(yī)學院病理教研室，海南 ?？?571199)

目的 分析熱休克蛋白27(HSP27)、上皮-鈣黏素(E-cadherin)及Ki-67在星型膠質(zhì)細胞腫瘤中的表達及意義。方法選取WHO分級為Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級星型膠質(zhì)細胞腫瘤標本共40例，采用免疫組化檢測HSP27、E-cadherin及Ki-67的表達。結果HSP27在Ⅱ級膠質(zhì)瘤的表達(8/13，61.5%)與Ⅲ級(12/13，92.3%)，Ⅳ級(14/14，100.0%)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而Ⅲ級和Ⅳ級的表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。87.5%(35/ 40)的膠質(zhì)瘤E-cadherin表達出現(xiàn)表達缺失或下降，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但與HSP27的表達之間存在負性趨勢。膠質(zhì)瘤Ki-67指數(shù)隨WHO分級增高而提高[Ⅱ級：(2.38±1.39)%、Ⅲ級：(11.07±9.73)%、Ⅳ級：(27.31±16.02)%]，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，并與HSP27的表達正相關(P＜0.05)。結論Hsp27與Ki-67的表達對判斷膠質(zhì)瘤組織學分級及增殖活性具有重要意義。E-cadherin表達下降可能在膠質(zhì)瘤形成早期即出現(xiàn)，可作為星型膠質(zhì)細胞發(fā)生瘤變的早期判斷指標。E-cadherin可能與HSP27共同參與膠質(zhì)瘤的演進。

熱休克蛋白27；上皮-鈣黏素；Ki-67；星型膠質(zhì)細胞腫瘤

星型膠質(zhì)細胞腫瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，根據(jù)WHO分類，主要包括彌漫性星型細胞瘤、間變性星型細胞瘤和多形性膠質(zhì)母細胞瘤。HSP27屬小熱休克蛋白家族成員(Small heat shock protein，sHSP)，在前列腺癌、肝癌、骨肉瘤等多種惡性腫瘤中均檢測到HSP27的異常表達，并與患者預后相關[1-2]。Shiota等[3]發(fā)現(xiàn)HSP27蛋白通過調(diào)節(jié)前列腺癌上皮間質(zhì)轉化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)和細胞周期，可提高癌細胞的侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤同樣存在EMT現(xiàn)象[4]。EMT是指腫瘤細胞失去上皮細胞極性，獲得較高的侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質(zhì)的能力。為此本實驗采用免疫組化檢測HSP27、E-cadherin和Ki-67蛋白在星型膠質(zhì)細胞腫瘤中的表達，探討三者在瘤細胞增殖活性及腫瘤發(fā)展過程中的生物學意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 40例樣本均來自?？谑腥嗣襻t(yī)院病理科診斷為星型膠質(zhì)細胞腫瘤病例，根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，包括彌漫性星型細胞瘤(WHOⅡ級)13例、間變性星型細胞瘤(WHOⅢ級)13例和多形性膠質(zhì)母細胞瘤(WHOⅣ級)14例；男23例，女17例，患者年齡2～78歲(中位年齡46歲)。所有患者術前均未行放、化療。對照組8例，均為癌旁正常膠質(zhì)組織。

1.2 試劑 HSP27(兔抗人多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司)、E-cadherin(鼠抗人單克隆抗體，北京中杉金橋生物技術有限公司)；Ki-67(鼠抗人單克隆抗體，福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)；免疫組化MaxVision檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。DAB顯色試劑盒和EDTA修復液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法 HSP27、E-cadherin及Ki-67免疫組化所用石蠟組織均4 μm切片，HSP27抗體濃度為1:100，其余一抗為即用型。切片脫蠟、水化，3%的H2O2封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗三次后高溫高壓修復，滴加一抗，室溫孵育1 h；PBS沖洗三次，滴加二抗，室溫下孵育20 min；PBS沖洗三次后，滴加DAB顯色劑，蘇木素復染，中性樹膠封片。實驗按照一抗說明書制備陽性對照。陰性對照用PBS液代替一抗制備。

1.4 結果判定 HSP27以胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，在陽性區(qū)域隨機選取4個高倍視野計算陽性細胞所占細胞總數(shù)百分比，判定標準[5]：陽性細胞數(shù)≤25%為(-)，26%～50%為(+)，51%～75%為(++)，＞76%為(+++)。E-cadherin以胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性[6]，按陽性細胞所占計數(shù)細胞總數(shù)百分比，判定標準[7]：陽性率10%～25%為(+)，26%～50%為(++)，＞50%為(+++)，無陽性或陽性細胞＜10%為(-)。Ki-67表達于細胞核，計算陽性細胞所占計數(shù)細胞總數(shù)百分比，判定標準：陽性細胞＜1%為0，1%～10%為(+)，10%～20%為(++)，＞20%為(+++)，各組陽性率以Ki-67指數(shù)表示(Ki-67指數(shù)=均數(shù)±標準差)。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間差異采用交叉表分析及非參數(shù)檢驗χ2分析，三者相關性分析采用非參數(shù)檢驗相關性分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 HSP27在不同級別膠質(zhì)瘤組中的表達 本組40例腫瘤中HSP27陽性表達為34例，總陽性率85.0%，其中Ⅱ級為61.5%(8/13)，Ⅲ級為92.3%(12/ 13)，Ⅳ級為100.0%(14/14)。統(tǒng)計學分析表明，Ⅱ級與Ⅲ級、Ⅳ級膠質(zhì)瘤之間的HSP27陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而Ⅲ級、Ⅳ級膠質(zhì)瘤之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖1和表1。

圖1 HSP27在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(×100)

表1 HSP27在不同級別膠質(zhì)瘤組中的表達(n=40)

2.2 Ki-67在不同級別膠質(zhì)瘤組中的表達 Ⅱ級膠質(zhì)瘤Ki-67指數(shù)為(2.38±1.39)%，Ⅲ級膠質(zhì)瘤為(11.07±9.73)%，Ⅳ級膠質(zhì)瘤為(27.31±16.02)%。采用兩兩比對分析表明：各級膠質(zhì)瘤組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。并且HSP27與Ki-67的表達之間存在正相關性(P＜0.05)，見表2。

表2 Ki-67在不同級別膠質(zhì)瘤組中的表達(n=40)

2.3 E-cadherin蛋白在不同級別膠質(zhì)瘤組中的表達 本研究中E-cadherin蛋白總陽性率為12.5% (5/40)。各組的表達率分別為15.4%(2/13)(WHOⅡ級)、7.7%(1/13)(WHOⅢ級)及14.3%(2/14)(WHOⅣ級)，組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖2、表3。

圖2 E-cadherin在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(×100)

表3 E-cadherin在不同級別膠質(zhì)瘤組中的表達(n=40，例)

3 討 論

HSP27又名27KD熱休克蛋白，由定位于7q11.23的HSPB1基因編碼，廣泛表達在各種細胞，是細胞內(nèi)信號傳導的重要調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)節(jié)細胞生長及凋亡等多種生物學功能。在正常細胞內(nèi)，HSP27因受細胞周期調(diào)控而維持于低水平，當細胞處于應激狀態(tài)或異常增生時，其合成增多從而促進細胞生長，抑制凋亡。研究證實，表達量異常的HSP27蛋白可通過多種信號通路或參與腫瘤EMT過程，促進腫瘤浸潤和轉移[8-9]。并且磷酸化修飾后的HSP27可能在IFN-β誘導的神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡中起重要調(diào)節(jié)作用[10]。另有研究表明，HSP27與多種腫瘤耐藥相關，Belkacemi等[11]通過抑制膠質(zhì)母細胞瘤中HSP27轉錄后，發(fā)現(xiàn)細胞對化療藥物的敏感性增加。而Zhang等[12]也通過抑制胰腺癌細胞內(nèi)HSP27的表達，證實細胞對抗腫瘤藥物敏感性增強，同時使E-cadherin表達上調(diào)，抑制瘤細胞浸潤和轉移。本研究中Ⅱ級星型膠質(zhì)細胞瘤HSP27陽性率為61.5%(8/13)，Ⅲ級為92.3%(12/13)，Ⅳ級為100.0%(14/14)，2級與Ⅲ級、Ⅳ級膠質(zhì)瘤比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而Ⅲ級、Ⅳ級腫瘤之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。8例腫瘤旁膠質(zhì)細胞中均無HSP27表達。以上實驗結果表明HSP27的表達與星型膠質(zhì)細胞腫瘤的WHO分級相關，這與高級別膠質(zhì)瘤(Ⅲ級、Ⅳ級)化療耐受的臨床特點一致。提示高表達的HSP27蛋白在膠質(zhì)瘤演進過程中起到重要作用。Ki-67蛋白反映細胞增殖活性。Chen等[13]認為Ki-67對于判斷膠質(zhì)瘤患者臨床特征及預后有重要意義。本研究結果亦提示隨膠質(zhì)瘤分級增高，Ki-67表達陽性率亦增高，其表達在不同級別膠質(zhì)瘤各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。本實驗結果表明，HSP27與Ki-67表達水平之間存在正相關性(P＜0.05)，推測高表達的HSP27蛋白可能通過抑制細胞凋亡，促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖。證實HSP27及Ki-67與膠質(zhì)瘤的分化及惡性程度有關，對判斷腫瘤分級有意義。

E-cadherin為細胞粘附分子，是重要的EMT標記物[14]，其表達下調(diào)可促進腫瘤細胞發(fā)生轉移。研究證實E-cadherin可在正常膠質(zhì)細胞中表達，但膠質(zhì)瘤中E-cadherin的表達與腫瘤分級的相關性分析在多個報道中不盡相同，Bar等[15]在對92例膠質(zhì)瘤病例的研究中發(fā)現(xiàn)28.8%的膠質(zhì)瘤表達E-cadherin，與分級無相關性。在本研究中，8例腫瘤旁膠質(zhì)細胞E-cadherin均表達，而膠質(zhì)瘤組織表現(xiàn)為E-cadherin的表達缺失或表達下降，其總表達率為12.5%(5/40)，組間表達差異無統(tǒng)計學意義。此外，因本組膠質(zhì)瘤組織中E-cadherin蛋白表達陽性例數(shù)較少，與HSP27、Ki-67表達相關性沒有得到確定的統(tǒng)計學結論，但存在負性趨勢。本實驗結果提示，EMT現(xiàn)象在星型膠質(zhì)細胞腫瘤組織中較普遍，E-cadherin的表達異?？赡茉谀[瘤形成早期即出現(xiàn)，可作為星型膠質(zhì)細胞腫瘤發(fā)展早期的參考指標，并可能與HSP27蛋白共同參與腫瘤的演進。

綜上所述，HSP27作為低分子量熱休克蛋白，參與星型膠質(zhì)細胞腫瘤演進，與瘤細胞的增殖活性相關，在判斷腫瘤惡性程度及腫瘤分級方面具有重要意義。E-cadherin表達下調(diào)可作為星型膠質(zhì)細胞腫瘤發(fā)展早期的參考指標，在腫瘤防治方面具有重要作用，但與高表達HSP27蛋白之間相關性有待進一步研究。

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Expression and significance of HSP27,E-cadherin and Ki-67 in astrocytic tumor.

RAO Xiang1,YANG Cheng2. 1.Department of Pathology,Haikou People's Hospital,Haikou 570108,Hainan,CHINA;2.Department of Pathology, Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo discuss the expression and significances of heat-shock protein 27(HSP27),E-cadherin and Ki-67 in astrocytic tumor.MethodsForty samples of astrocytic tumor were diagnosed by the Department of Pathology of Haikou People's Hospital and divided into diffusely astrocytoma(WHO gradeⅡ,13 cases),astrocytoma (WHO gradeⅢ,13 cases)and glioblastoma multiforme(WHO gradeⅣ,14 cases)according to WHO clasification of tumours of the central nervous system.Expression of HSP27,E-cadherin and Ki-67 was detected by immunohistochemistry.ResultsThe positive expression of HSP27 in the gradeⅡ(8/13,61.5%)and gradeⅢ(12/13,92.3%),gradeⅣgliomas(14/14,100.0%)were significantly different(P＜0.05).However,there was no significant difference in the expression of HSP27 between gradeⅢandⅣastrocytoma(P＞0.05).The rate of E-cadherin expression missing or decreased were 87.5%(35/40)in astrocytoma,and there was no significant difference among the three groups(P＞0.05).E-cadherin expression showed negative trend with the expression of HSP27.The Ki-67 index of astrocytoma increased with the increase of WHO grade[gradeⅡ:(238±1.39)%,gradeⅢ:(11.07±973)%,gradeⅣ:(27.31±1.602)%],and the difference between the groups has statistical significance(P＜0.05).Ki-67 index was positively correlated with the expression of HSP27(P＜0.05).ConclusionExpression of HSP27 and Ki-67 is meaningful to evaluate tumor pathologic grading and associated with the biological behavior of astrocytic tumor.Abnormal expression of E-cadherin maybe an early event in the process of tumorigenesis,which can be regarded as an index for early diagnosis.The low expression of E-cadherin and over expression of hsp27 may play an important role in the development of astrocytic tumor.

Heat-shock protein 27(HSP27);E-cadherin;Ki-67;Astrocytic tumor

R730.264

A

1003—6350（2016）10—1579—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.010

2015-11-01)

楊丞。E-mail：yangcheng6@sina.com