陳凱，王珂，潘宣，吳妹娟，馬映霞，龔攀

（1.廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510080；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510095）

舌鱗癌組織中VEGFR-3和淋巴管密度的表達(dá)及其臨床病理意義

陳凱1，王珂1，潘宣1，吳妹娟1，馬映霞1，龔攀2

（1.廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510080；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510095）

目的 檢測舌鱗癌組織中血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR-3)和淋巴管密度(LVD)的表達(dá)水平，探討其與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。方法選取2006年1月至2014年5月搜集的舌鱗癌標(biāo)本60例和正常舌體標(biāo)本12例，采用免疫組化染色法檢測組織中VEGFR-3和LVD的表達(dá)水平，運(yùn)用SPSS19.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析VEGFR-3與腫瘤LVD之間的相關(guān)性及臨床病理意義。結(jié)果VEGFR-3在舌鱗癌組織中的高表達(dá)率為56.67%，對照組為25.00%；LVD在舌鱗癌組織中的高表達(dá)率為58.33%，對照組為16.67%；舌鱗癌中VEGFR-3和LVD的表達(dá)明顯高于正常舌組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。VEGFR-3和LVD的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(PVEGFR-3=0.043，PLVD=0.019)、臨床分期(PVEGFR-3=0.006，PLVD=0.015）及生存狀態(tài)(PVEGFR-3=0.028，PLVD=0.015)之間均具有相關(guān)性；VEGFR-3和LVD在舌鱗癌中具有正相關(guān)性(r=0.916，P＜0.001)。結(jié)論VEGFR-3和淋巴管密度與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，可作為指導(dǎo)舌鱗癌診治及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。

舌鱗癌；血管內(nèi)皮生長因子受體3；淋巴管密度；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

舌癌是最常見的口腔癌，絕大多數(shù)為上皮來源的鱗癌，其發(fā)病率已呈現(xiàn)上升趨勢，在全身惡性腫瘤中占據(jù)第6位[1-2]。由于舌體本身特殊的解剖結(jié)構(gòu)和生理特性，舌鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，局部復(fù)發(fā)率高，往往危及患者生命；目前以手術(shù)為主、放化療為輔的綜合治療方案已普遍運(yùn)用于舌鱗癌的臨床治療，但舌鱗癌患者的5年總體生存率仍然停留在50%～60%[3-4]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子受體3 (Vessel endotheliumgrowth factor receptor 3，VEGFR-3)及腫瘤淋巴管密度(Lymphatic vessel density，LVD)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。本研究通過采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測VEGFR-3和淋巴管密度在舌鱗癌組織中的表達(dá)情況，進(jìn)而探討VEGFR-3、淋巴管密度與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為探索舌鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制、提高舌鱗癌的治療效果提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 選取廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科2006年1月至2014年5月病理科收集的舌癌切除及頸淋巴清掃術(shù)患者的石蠟包埋標(biāo)本60例為實(shí)驗(yàn)組；選取正常舌黏膜12例(外傷后手術(shù)切除組織)為對照組。所有病例均有完整的臨床資料及隨訪記錄，診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2010年國際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)制定的舌鱗癌的TNM分類和臨床分期。

1.2 試劑和方法 所有樣本均經(jīng)10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋。將實(shí)驗(yàn)石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，厚為4 μm，免疫組織化學(xué)染色法檢測VEGFR-3、LYVE-1的表達(dá)，各項(xiàng)步驟均按試劑說明書操作，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。羊抗人LYVE-1多克隆抗體購自R&D公司；羊抗人VEGFR-3多克隆抗體購自北京中杉生物技術(shù)公司；GTVisionTMⅢ抗羊免疫組化檢測試劑盒購自上海基因公司。

1.3 結(jié)果判定 (1)VEGFR-3蛋白：VEGFR-3蛋白多表達(dá)于胞漿和胞膜中，胞漿和胞膜中有棕黃色顆粒沉著的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。在染色均勻的腫瘤區(qū)，選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，按照陽性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行評估：依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例0，1%～10%，11%～49%，50%～100%，分別計(jì)作0、1、2、3分；依據(jù)無染色，染色淡黃色、黃色、棕黃色分別計(jì)作0、1、2、3分；二者乘積作為總分，0～3分為低表達(dá)，4～9分為高表達(dá)。(2)淋巴管密度(LVD)：LYVE-1陽性染色為胞漿和胞膜棕黃色染色；在本實(shí)驗(yàn)中具有管腔結(jié)構(gòu)的LYVE-1陽性陽性標(biāo)記的淋巴管用于LVD的計(jì)數(shù)。首先在低倍鏡下選擇5個(gè)染色清晰、背景對照良好的區(qū)域，然后在200倍鏡視野下記錄脈管數(shù)目，取其均數(shù)作為該樣本的淋巴管密度。根據(jù)本研究中LVD表達(dá)的具體情況，將LVD位于0～10之間者作為低表達(dá)組，而大于10者納入高表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，Spearman等級相關(guān)分析腫瘤中VEGFR-3表達(dá)與腫瘤淋巴管密度的關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VEGFR-3在正常組織及舌鱗癌中的表達(dá)情況 VEGFR-3陽性表達(dá)定位于舌鱗癌癌細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色染色顆粒(見圖1、圖2)。本實(shí)驗(yàn)中，VEGFR-3在舌鱗癌組中高表達(dá)34例，低表達(dá)26例，高表達(dá)率為56.67%，低表達(dá)率為43.33%；在對照組中，高表達(dá)3例，低表達(dá)9例，高表達(dá)率為25.00%，而低表達(dá)率為75.00%(見圖3)。VEGFR-3在舌鱗癌中的高表達(dá)率明顯高于在正常舌組織中的高表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.01，P=0.045)。

圖2 舌鱗癌組織免疫組化染色VEGFR-3低表達(dá)(×400)

圖3 正常舌組織免疫組化染色VEGFR-3低表達(dá)(×400)

2.2 LVD在正常組織及舌鱗癌中的表達(dá)情況 LYVE-1陽性表達(dá)定位于舌鱗癌組織中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞膜中，呈棕黃色顆粒(見圖4、圖5)。本實(shí)驗(yàn)中，舌鱗癌組織中的淋巴管常由多個(gè)小的不成形的管腔構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，管腔呈塌陷或擴(kuò)張狀態(tài)。LVD在舌鱗癌組中高表達(dá)35例，低表達(dá)25例，高表達(dá)率為58.33%，低表達(dá)率為41.67%；在對照組中高表達(dá)2例，低表達(dá)10例，高表達(dá)率為16.67%，而低表達(dá)率為83.33%(見圖6)。舌鱗癌組織中LVD的高表達(dá)率明顯高于在正常舌組織中LVD的高表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.95，P=0.008)。

圖4 舌鱗癌組織免疫組化染色LYVE-1低表達(dá)（200×）

圖5 舌鱗癌組織免疫組化染色LYVE-1高表達(dá)(200×)

圖6 正常舌組織免疫組化染色LYVE-1低表達(dá)(200×)

2.3 VEGFR-3表達(dá)、腫瘤LVD與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 VEGFR-3的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P= 0.043)、臨床分期(P=0.006)及生存狀況(P=0.028)之間均具有相關(guān)性，而與患者的性別、年齡、腫瘤T分類及分化程度無關(guān)；腫瘤LVD的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P= 0.019)、臨床分期(P=0.015)、生存狀態(tài)(P=0.015)之間均具有相關(guān)性，見表1。而VEGFR-3的高表達(dá)與腫瘤LVD的高表達(dá)呈正相關(guān)，Spearman等級相關(guān)系數(shù)為0.915(P＜0.01)。

表1 舌鱗癌組織LVD、VEGFR-3表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

3 討 論

舌癌主要通過淋巴道轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是舌癌患者最重要的預(yù)后指標(biāo)之一。但長期以來，由于缺乏特異的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物，關(guān)于腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的具體過程和具體方式一直爭論較多，對腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的研究也遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于血管轉(zhuǎn)移。近年來，一系列淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物和淋巴管生成特異性調(diào)控因子的相繼發(fā)現(xiàn)，極大地加快了對淋巴管生成研究的速度。已有眾多的實(shí)驗(yàn)研究證明，腫瘤組織中的淋巴管生成在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用[5-7]。淋巴管為腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移提供了直接通道，并與患者不良預(yù)后有關(guān)[8]。Liang等[9]在對直腸癌進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)：同無淋巴管浸潤的腫瘤相比，在有淋巴管浸潤現(xiàn)象的腫瘤中，其LVD明顯增高，且瘤體的LVD與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。蘇震等[10]通過對膀胱癌的觀察發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織LVD明顯高于正常組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組LVD高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，浸潤超過肌層組LVD高于浸潤未超過肌層組。實(shí)驗(yàn)還得出結(jié)論：在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中，LVD的升高是一個(gè)不良信號，即正常組織在惡變的過程中淋巴管的生成加快，進(jìn)而加速了組織的惡變進(jìn)程，淋巴管生成與膀胱癌的形成及其侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)舌鱗癌組織中LVD的高表達(dá)率明顯高于正常舌組織，而且腫瘤LVD的高表達(dá)與舌鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及患者的生存狀態(tài)均具有相關(guān)性，這和上述學(xué)者的研究結(jié)果基本一致。

VEGFR-3是一種酪氨酸激酶受體，結(jié)構(gòu)上由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)組成。在正常的成人個(gè)體中，VEGFR-3幾乎只特異性地表達(dá)在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上。VEGFR-3與VEGF-C/D結(jié)合后發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)：誘導(dǎo)脈管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，調(diào)控淋巴管的生成，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的生長轉(zhuǎn)移。目前大多數(shù)學(xué)者都認(rèn)為，VEGF-C/D-VEGFR-3機(jī)制調(diào)控著淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和淋巴管的生成[11]。Stearns等[12]研究發(fā)現(xiàn)在有前哨淋巴結(jié)參與的原發(fā)性腫瘤中，VEGFR-3的表達(dá)水平明顯提高，通過抑制VEGFR-3的表達(dá)可能對阻斷腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有重要的意義。盧壁輝等[13]通過對結(jié)腸癌的研究發(fā)現(xiàn)VEGFR-3在腫瘤組織中的表達(dá)顯著增高，而且VEGFR-3的高表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)VEGFR-3在舌鱗癌組織中的高表達(dá)顯著高于正常組織，VEGFR-3的高表達(dá)與舌鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明、臨床分期及生存狀況具有明顯相關(guān)性；我們還發(fā)現(xiàn)VEGFR-3的高表達(dá)與腫瘤LVD存在正相關(guān)性。考慮VEGFR-3表達(dá)水平增高并與VEGF-C/D結(jié)合后，刺激新生淋巴管生成、改善管腔通透性及內(nèi)外壓力差，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

VEGFR-3和LVD在舌鱗癌的發(fā)展過程中起著重要作用，二者的聯(lián)合檢測可以作為預(yù)測舌鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和指導(dǎo)臨床診治的重要指標(biāo)。

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Expression of VEGFR-3 and LVD in tongue squamous cell carcinoma and their clinical pathological significance.

CHEN Kai1,WANG Ke1,PAN Xuan1,WU Mei-juan1,MA Ying-xia1,GONG Pan2.1.Department of Stomatology,the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510080,Guangdong,CHINA;2.Department of Stomatology,the Cancer Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate vascular endothelial growth factor receptor-3(VEGFR-3)and lymphatic vessel density(LVD)relationships with clinical pathological indicators through studying their expression in tongue squamous cell carcinoma.MethodsSixty cases of tongue squamous cell carcinoma(TSCC)and 12 cases of normal tongue were collected from January 2006 to May 2014,and the expression of VEGFR-3 and LVD in these cases were detected by immunohistochemical staining.SSPS19.0 software was used to process the experimental data and analyze the correlation between VEGFR-3 and LVD,and their clinical pathological significance.ResultsThe expression rate of VEGFR-3 in TSCC and normal tongue were respectively 56.67%and 25.00%(P=0.045).The expression rate of LVD in TSCC and normal tongue were respectively 58.33%and 16.67%(P=0.008).The expression of VEGFR-3 and LVD in TSCC were significantly higher than in normal tongue(P＜0.05).The expression of VEGFR-3 and LVD were significantly associated with lymph node metastasis(PVEGFR-3=0.043,PLVD=0.019),clinical stage(PVEGFR-3=0.006,PLVD=0.015)and living conditions(PVEGFR-3=0.028,PLVD=0.015).The expression of VEGFR-3 had a positive correlation with the expression of LVD(r=0.916,P＜0.001).ConclusionVEGFR-3 and LVD are closely correlated to invasion,metastasis and prognosis of TSCC.So they can be the important indicators for guiding the diagnosis and treatment,and judging the prognosis of TSCC.

Tongue squamous cell carcinoma(TSCC);Vascular endothelial growth factor receptor-3(VEGFR-3);Lymphatic vessel density(LVD);Lymph node metastasis

R739.86

A

1003—6350（2016）10—1575—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.009

2015-12-15)

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金指令性課題項(xiàng)目(編號：C2015031)；廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院院內(nèi)課題項(xiàng)目（編號：201218）；廣州醫(yī)科大學(xué)青年科研項(xiàng)目(編號：2014A37)

潘宣。E-mail：603200275@qq.com