吳立兵，劉剛，王衛(wèi)民

(十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，湖北十堰442000)

放射性125I粒子對肺癌A549細胞裸鼠移植瘤VEGF表達的影響

吳立兵，劉剛，王衛(wèi)民

(十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，湖北十堰442000)

目的探討放射性125I粒子對肺癌A549細胞裸鼠移植瘤血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達的影響。方法建立肺癌A549細胞裸鼠移植瘤模型，將24只小鼠隨機分為對照組和觀察組，每組12只。觀察組小鼠植入125I粒子，對照組小鼠植入空白粒子。檢測裸鼠移植瘤體積、瘤重，計算抑瘤率。采用免疫組織化學法檢測移植瘤組織內VEGF蛋白表達。采用PCR法檢測移植瘤組織內VEGF mRNA表達。結果觀察組小鼠移植瘤體積及瘤重[(0.658±0.213)g]均明顯小于對照組[(1.807±0.625)g]，組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；觀察組小鼠平均抑瘤率為(68.2±5.3)%；觀察組移植瘤中VEGF蛋白表達及VEGF mRNA表達分別為(22.6±5.9)、(98.7±8.2)，均明顯低于對照組的(58.5±6.4)、(138.7±5.2)，組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論放射性125I粒子植入可顯著抑制肺癌A549細胞裸鼠移植瘤生長，抑制VEGF表達可能是其主要作用機制。

肺癌；放射性125I粒子；血管內皮細胞生長因子；表達

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一。近幾十年來，隨著汽車尾氣、工業(yè)污染等問題所導致的大氣污染日趨嚴重，肺癌的發(fā)病率及病死率居高不下，已成為嚴重威脅世界人民健康的公共衛(wèi)生問題[1]。由于起病隱匿，約85%的肺癌患者確診時已為晚期，失去了最佳的手術機會[2]。放射性125I粒子是一類人工同位素，將其直接植入腫瘤內可持續(xù)釋放射線，起到殺傷腫瘤細胞的作用，是晚期肺癌治療的重要手段之一[3-4]。由于125I粒子治療肺癌的作用機制尚未明確，本研究擬通過觀察125I粒子對肺癌A549細胞裸鼠移植瘤生長及其對移植瘤組織血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達的影響，探討125I粒子治療肺癌的作用機制，旨在為臨床治療提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料肺癌細胞株A549(ATCC細胞庫，美國)；RNA提取試劑盒、PCR試劑盒、質粒提取試劑盒(Invitrogen，美國)；DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶(Gibco公司，美國)；MTT(Sigma，美國)；VEGF兔源單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)；免疫組化試劑盒(南京建成生物有限公司，中國)。試驗動物：24只BALB/c小鼠，雌性，8周齡，體重18～22 g，SPF級，購于上海斯萊克試驗動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)復蘇A549，PBS洗滌3次，DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，用含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)液將細胞混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。

1.2.2 裸鼠模型制備收集對數(shù)生長期的A549并配成濃度為3×107個/ml單細胞懸液。每只裸鼠背部皮下注射0.2 ml上述細胞懸液后常規(guī)飼養(yǎng)。待移植瘤直徑達5 mm時可視為接種成功。

1.2.3 動物分組及給藥按隨機數(shù)字表法將模型小鼠分為對照組和觀察組，每組12只。待腫瘤體積達到120 mm3時觀察組小鼠植入125I粒子，對照組小鼠植入空白粒子。粒子植入前應做好防護工作，125I粒子浸泡于戊二醛中消毒30 min，植入部位常規(guī)消毒，采用18號植入針在距腫瘤邊緣5 mm處刺破皮膚，并于皮下潛行至腫瘤中心部位，植入粒子。常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察28 d后斷頸處死。

1.3 腫瘤生長情況分別于植入粒子前、植入粒子后7 d、14 d、21 d、28 d，測量腫瘤體積，腫瘤體積= (長徑×短徑2)/2。植入粒子后28 d取出瘤體，稱重，計算腫瘤抑制率，腫瘤抑制率=(對照組平均瘤重-觀察組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.4 VEGF蛋白表達采用免疫組織化學法檢測移植瘤組織VEGF蛋白表達。常規(guī)制備移植瘤組織切片，3%H2O2阻斷內源性過氧化酶活性，組織抗原修復，封片，滴加VEGF一抗(1:1 000)，4℃孵育過夜，洗片，二抗室溫孵育1 h，鏈霉素抗生素蛋白工作液孵育，DAB顯色，復染、脫水、透明、固定。PBS代替一抗作為對照組。在細胞質、細胞核、細胞膜中呈現(xiàn)棕黃色為陽性。圖像分析：在20倍物鏡下，隨機選取100個陽性細胞檢測平均灰度值，平均灰度值=(背景灰度值-實測灰度值)，平均灰度值越小，則代表VEGF蛋白表達越高。

1.5 VEGF mRNA表達采用PCT法檢測移植瘤組織VEGF mRNA表達。常規(guī)提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，所得反應產(chǎn)物進行PCR擴增(SYBR Green法)。以GAPDH為內參，引物序列，見下表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均值±標準差(±s)表示，組間差異比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤生長情況治療后觀察組移植瘤體積均顯著小于對照組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1；治療后28 d，對照組和觀察組瘤重分別為(1.807±0.625)g、(0.658±0.213)g；觀察組平均抑瘤率為(68.2±5.3)%。

圖1 兩組各時點移植瘤體積比較

2.2 VEGF蛋白表達免疫組化檢測結果顯示，治療后28 d觀察組和對照組VEGF灰度值分別為(98.7±8.2)、(138.7±5.2)；觀察組移植瘤的VEGF灰度值明顯低于對照組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2。

2.3 VEGF mRNA表達PCR結果顯示，治療后28 d對照組和觀察組VEGF mRNA表達分別為(58.5±6.4)、(22.6±5.9)，觀察組移植瘤中VEGF mRNA表達明著低于對照組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖2 治療后28 d各組小鼠移植瘤VEGF陽性表達情況

3 討論

放射性125I粒子植入是一種治療惡性腫瘤的新方法[5]。與外放射治療相比較，采用放射性125I粒子體內近距離植入放療可對靶腫瘤產(chǎn)生持續(xù)、低劑量的照射作用，從而大大提高放療的持久性和準確性[6-7]。大量研究證實，采用放射性125I粒子植入治療中晚期肺癌具有較高的安全性，且近期療效肯定[8]。但放射性125I粒子植入治療的作用機制尚未完全明確。

血管新生是惡性腫瘤的生長特性，也是惡性腫瘤生長、轉移的先決條件。VEGF作為已知活性最強的促血管生成素，可通過與血管內皮細胞膜表面的VEGF受體(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)相結合，激活多條信號轉導通路，介導級聯(lián)反應，誘發(fā)血管內皮細胞有絲分裂，促進內皮細胞增殖和血管生成，從而參與血管新生過程，其表達水平與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[9]。姚傳山等[10]研究證實，肺癌組織中VEGF呈現(xiàn)高表達，與癌旁組織比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且VEGF表達陽性率與腫瘤TNM分期及有無淋巴轉移有關。張泳等[11]采用RNAi干涉法沉默A549中VEGF表達，并將其接種于裸鼠，結果顯示沉默VEGF表達可明顯抑制裸鼠內皮細胞小管形成，抑制移植瘤生長，延長裸鼠生存期，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。因此認為，調控VEGF表達對于控制肺癌進展、遠處轉移及復發(fā)等均具有重要意義[12]。本研究結果顯示，放射性125I粒子植入后，肺癌A549細胞裸鼠移植瘤組織中VEGF蛋白表達及mRNA表達均顯著減少，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示放射性125I粒子植入可抑制肺癌移植瘤組織中VEGF高表達，從而對腫瘤血管新生發(fā)揮著一定的調控作用[13]。此外，本研究還觀察到放射性125I粒子植入后肺癌A549細胞裸鼠移植瘤體積和重量明顯減少，抑瘤率高達(68.2±5.3)%，與徐燕等[14]研究報道一致，因此抑制VEGF表達可能是放射性125I粒子發(fā)揮抑瘤作用的主要機制。

綜上所述，放射性125I粒子植入可顯著抑制肺癌A549細胞裸鼠移植瘤生長，抑制VEGF表達可能是其主要作用機制。關于放射性125I粒子植入是否還通過調節(jié)其他活性因子及信號通路發(fā)揮殺傷惡性腫瘤細胞的作用仍未知，有待進一步深入研究。

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Effect of radioactive125I seed on expression of VEGF in lung cancer A549 cell of nude mice.

WU Li-bing,LIU Gang, WANG Wei-min.Department of Nuclear Medicine,Shiyan Taihe Hospital(Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine),Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of radioactive125I seed implantation on expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in lung cancer A549 cell of nude mice.MethodsLung cancer xenograft models on nude mice were established,which were divided into control group and observation group randomly,with 12 mice in each group.The observation group was implanted with125I seed,and the control group was given blank seed.The size and weight of xenograft tumor were detected,and the tumor inhibition rate was calculated.The expression of VEGF protein in xenograft tumor was detected by immunohistochemical method.The expression of VEGF mRNA in xenograft tumor was detected by PCR method.ResultsThe size and weight of xenograft tumor in the observation group were significantly less than those in the control group[(0.658±0.213)g vs(1.807±0.625)g],with statistically significant difference(P＜0.05).The tumor inhibition rate of the observation group was(68.2±5.3)%.The expression of VEGF protein and VEGF mRNA of xenograft tumor in the observation group[(22.6±5.9),(98.7±8.2)]were significantly lower than those in the control group[(58.5±6.4),(138.7±5.2)],with statistically significant difference(P＜0.05).ConclusionRadioactive125I seed can significantly inhibit the growth of xenograft tumor of lung cancerA549 cell in nude mice,and inhibition of VEGF expression may be the main mechanism.

Lung cancer;Radioactive125I seed;Vascular endothelial growth factor(VEGF);Expression

R-332

A

1003—6350（2016）02—0183—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.02.004

2015-07-07)

吳立兵。E-mail：wuerfan@sina.com