胡鵬，王衛(wèi)星，王鵬，鄧文宏，余佳

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院普通外科，湖北 武漢 430060)

·論 著·

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在肝癌組織中的表達(dá)及其與VEGF的相關(guān)性

胡鵬，王衛(wèi)星，王鵬，鄧文宏，余佳

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院普通外科，湖北 武漢 430060)

目的 研究腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)在肝癌中的表達(dá)及其與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)雙染方法檢測2010年1月至2014年1月在我院行肝癌切除術(shù)后收集的肝癌組織標(biāo)本95例，采用免疫組化法分別檢測組織中CD163(TAMs標(biāo)記物)及VEGF的表達(dá)，光鏡下對TAMs計(jì)數(shù)及VEGF陽性表達(dá)進(jìn)行分析，并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果在肝癌組織分期Ⅰ～Ⅱ期的肝癌組織中TAMs平均浸潤(38.39±22.13)個(gè)，Ⅲ～Ⅳ期的肝癌組織中TAMs平均浸潤(48.95±25.32)個(gè)(P＜0.05)，未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌患者組織中TAMs平均浸潤(37.41±22.48)個(gè)，而出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌患者組織中TAMs平均浸潤(47.56±26.45)個(gè)(P＜0.05)。VEGF主要是在腫瘤細(xì)胞中呈中等強(qiáng)度表達(dá)；并且其表達(dá)強(qiáng)度與TAMs計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.782，P＜0.05)。結(jié)論TAMs在肝癌組織中的表達(dá)與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移特性以及分期有密切關(guān)系，并與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示TAMs與VEGF的表達(dá)可用來預(yù)測腫瘤的惡性程度，以及作為肝癌的輔助治療和改善預(yù)后的潛在靶點(diǎn)。

肝癌；腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子；相關(guān)性

肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)的發(fā)病率居全球男性腫瘤發(fā)病原因前列，是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一[1]。近年來，腫瘤微環(huán)境在其發(fā)生、發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用。存在于微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞(TAMs)表達(dá)多種特異抗原，例如CD163、CD68等，被作為抗腫瘤作用較強(qiáng)的起關(guān)鍵作用的細(xì)胞，而且現(xiàn)在TAMs與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系逐漸被重視[2]。TAMs具有促進(jìn)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用，這種作用是通過參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、血管生成等產(chǎn)生的。據(jù)文獻(xiàn)表明，TAMs對缺氧比較敏感，表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子相對較多，常聚集于微血管周邊，而在血管的生成過程中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)起到關(guān)鍵性的作用[3-4]。本文通過收集臨床上肝癌患者的組織標(biāo)本，并運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測CD163與VEGF在肝癌組織中的表達(dá)，探討TAMs在肝癌組織中的表達(dá)以及與VEGF的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科2014年1月至2015年6月期間行肝切除術(shù)并術(shù)后病理切片證實(shí)為肝細(xì)胞癌的95例石蠟標(biāo)本，患者術(shù)前未行放、化療等抑制腫瘤生長的治療。其中男性76例，女性19例；年齡37～78歲，甲胎蛋白(AFP)≤400 μg/L者43例，AFP≥400 μg/L者52例；肝包膜完整者57例，不完整者38例；分化程度低者63例，分化程度高者32例；肝癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期37例；肝癌腫瘤組織Edmondson分級：Ⅰ～Ⅱ級61例，Ⅲ～Ⅳ級34例。

1.2 主要試劑 鼠抗人CD163單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；免疫組化試劑盒，免疫組化雙染試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 免疫組化染色 標(biāo)本先行甲醛固定，后行石蠟包埋，做成3 μm厚的切片。免疫組化染色嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)步驟操作。首先使用隨機(jī)方法選擇10個(gè)高倍鏡下的視野，統(tǒng)計(jì)胞漿變成棕色的陽性細(xì)胞在其中的百分比，半定量標(biāo)準(zhǔn)如下：＜10%(-)，≥10%(+)，實(shí)驗(yàn)使用含有牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對照，陽性對照片由試劑公司提供。

1.4 TAMs計(jì)數(shù) 采用Leek等[5]使用的計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：先采用低倍鏡觀察并選取巨噬細(xì)胞比較密集的3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后在高倍鏡下進(jìn)行記數(shù)，最后獲得三組的平均數(shù)用來分析。

1.5 VEGF的表達(dá)測定 采用半定量積分法判定結(jié)果。陽性細(xì)胞數(shù)在5%以內(nèi)判為0分，5%～25%判為1分，25%～50%判為2分，50%～75%判為3分，大于75%判為4分；將細(xì)胞質(zhì)染色為無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分四個(gè)等級。將上述所得結(jié)果的乘積作為VEGF的最終判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Spearmanm Rank程序進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 TAMs與VEGF在肝癌組織中的表達(dá) VEGF、CD163染色主要存在于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜也有部分染色，見圖1、圖2。肝癌組織中VEGF與CD163的表達(dá)明顯高于正常肝臟組織。

圖1 CD163在不同肝臟組織中的表達(dá)

圖2 VEGF在不同肝臟組織中的表達(dá)

2.2 肝癌組織中TAMs與VEGF的表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系 TAMs浸潤程度與腫瘤轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P＜0.05)，見表1。VEGF在分化程度低的肝癌中的陽性率明顯高于分化程度高者(P＜0.05)；VEGF的表達(dá)水平在Ⅰ～Ⅱ期肝癌組織中均比Ⅲ～Ⅳ期高(P＜0.05)；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞中TAMs的陽性率明顯高于未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)，見表2。

表1 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系

表2 肝癌組織中VEGF陽性表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系

2.3 TAMs計(jì)數(shù)與VEGF表達(dá)之間的關(guān)系 在浸潤的間質(zhì)細(xì)胞和癌細(xì)胞中，VEGF主要是在腫瘤細(xì)胞中呈中等強(qiáng)度表達(dá)；經(jīng)Sperrman相關(guān)分析，肝癌組織中VEGF的表達(dá)強(qiáng)度與TAMs計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.782，P＜0.05)，見圖3。

圖3 TAMs與VEGF的相關(guān)性：r=0.782，P＜0.05

3 討 論

近年來，炎癥在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到不可替代的作用，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)分布于腫瘤免疫微環(huán)境中，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用，越來越成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞存在于大多數(shù)腫瘤微環(huán)境之中，它們通過影響周圍炎性介質(zhì)的產(chǎn)生、細(xì)胞增殖信號、組織結(jié)構(gòu)重塑、血管生成來促進(jìn)腫瘤的生長。近來，TAMs在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中被廣泛關(guān)注。常規(guī)來說，TAMs存在于大多數(shù)惡性腫瘤組織中，并且腫瘤內(nèi)部及周圍均有腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤。TAMs活化之后釋放大量炎癥介質(zhì)，對腫瘤組織、細(xì)胞以及腫瘤周圍組織、細(xì)胞產(chǎn)生影響，這可以導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂及免疫沉默。TAMs轉(zhuǎn)移到腫瘤當(dāng)中，并不起殺死腫瘤細(xì)胞的作用，而是促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。多項(xiàng)研究顯示，在腫瘤微環(huán)境中TAMs更容易極化成M2型巨噬細(xì)胞并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲跟轉(zhuǎn)移。而CD163是M2型巨噬細(xì)胞特異性較高的一個(gè)標(biāo)志物，目前認(rèn)為其具有減弱炎癥損傷，促進(jìn)腫瘤生長、侵襲的重要作用[6-8]。

研究發(fā)現(xiàn)，氧含量的高低可以影響TAMs的表達(dá)，TAMs喜厭氧環(huán)境，多分布在肝癌等惡性腫瘤的缺氧部位。低氧環(huán)境可使細(xì)胞分泌前列腺素增加，提高了TAMs對趨化因子的敏感性，并誘導(dǎo)TAMs轉(zhuǎn)移到腫瘤缺氧部位[9]。作為腫瘤侵潤白細(xì)胞的一個(gè)主要成分，TAMs在腫瘤的發(fā)展中起到?jīng)Q定性的作用，這個(gè)作用是通過表達(dá)趨化因子、生長因子(VEGF)、金屬蛋白酶類發(fā)揮的。而其中VEGF在其中起最重要的作用。

腫瘤生長最重要的是靠腫瘤血管的供血，而腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移又依靠腫瘤血管。研究證實(shí)，腫瘤生長如果沒有新生血管提供充足的血液則會停止生長，血管生成是肝癌生長的基礎(chǔ)，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向身體的各個(gè)器官轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長因子具有非常強(qiáng)的促進(jìn)血管生長的作用，在誘導(dǎo)腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用[10]。通過查閱文獻(xiàn)得知，VEGF高表達(dá)于肝癌組織中[11]。本文通過對肝癌患者臨床資料的整理以及免疫組化研究了VEGF及CD163在該部分患者組織中的表達(dá)情況，得出以上結(jié)果并通過表格及免疫組化圖片證明，由以上結(jié)果可以看出VEGF在肝癌生長、轉(zhuǎn)移以及癌癥復(fù)發(fā)中起至關(guān)重要的作用，并可以為肝癌的治療以及預(yù)后提供重要的依據(jù)。VEGF在肝癌Ⅲ～Ⅳ期中的表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期中的表達(dá)(P＜0.05)，由此得出VEGF在促進(jìn)肝癌的生長中起重要作用，其機(jī)制可能與VEGF具有促進(jìn)腫瘤血管生成增多有關(guān)。其表達(dá)水平的增高，可以作為預(yù)測肝癌臨床預(yù)后的重要的生物學(xué)指標(biāo)之一。

TAMs是腫瘤微環(huán)境中的主要組成部分，并通過多種途徑在腫瘤發(fā)生、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及免疫抑制等方面起著促腫瘤作用[12]。在以上研究中得出，VEGF表達(dá)強(qiáng)度與TAMs計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。由此得出，在肝癌中TAMs可能是通過促進(jìn)VEGF表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管的形成。

綜上所述，TAMs與VEGF在肝癌組織中的高度表達(dá)并與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移特性以及分期有密切關(guān)系，因此推斷TAMs可能通過促進(jìn)VEGF的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長，并且可以以此判斷腫瘤的惡性程度，為肝癌的臨床治療和預(yù)后提供新的線索。

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Expression of tumor-associated macrophage in the tissue of hepatocellular carcinoma and the correlation with vascular endothelial growth factor.

HU Peng,WANG Wei-xing,WANG Peng,DENG Wen-hong,YU Jia.Department of General Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of tumor-associated macrophages in hepatocellular carcinoma and its correlation with vascular endothelial growth factor(VEGF).MethodsNinety-five samples of hepatocellular carcinoma tissue collected from the patients undergoing hepatectomy from January 2010 to January 2014 in our hospital were detected by double immunohistochemical staining.The expression of CD163(TAMs marker)and VEGF in hepatocellular carcinoma were detected by immunohistochemistry.Then TAMs count and the positive expression of VEGF were analyzed under light microscope,and their relationship with clinical pathological parameters were analzyed.ResultsThe average infiltration of TAMs was(38.39±22.13)in hepatocellular carcinoma of stageⅠ～Ⅱ, (48.95±25.32)in hepatocellular carcinoma of stageⅢ～Ⅳ(P＜0.05),which was(37.41±22.48)in the patients without distant metastasis and(47.56±26.45)in the patients with distant metastasis(P＜0.05).VEGF was moderately expressed in hepatocellular carcinoma,and the expression intensity was positively correlated with TAMs count(r= 0.782,P＜0.05).ConclusionThe expression of TAMs in the hepatocellular carcinoma has close relationship with the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma as well as staging,and it is positively correlated with expression of VEGF.The expression of TAMs and VEGF can be used to predict the malignant degree of tumor,and as an adjuvant therapy of liver cancer and potential targets to improve the prognosis.

Hepatocellular carcinoma;Tumor-associated macrophages;Vascular endothelial growth factor (VEGF);Correlation

R735.7

A

1003—6350（2016）05—0689—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.001

2015-11-12)

國家自然科學(xué)基金(編號：81370562)；國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號：81300356)；天晴肝病扶持基金(編號：TQGB20140182)

王衛(wèi)星。E-mail:sate.llite@163.com