蔡亮，張凌華，楊子杰，裘麗珍

復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，上海 200433

嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)免疫療法：絕處逢生的利劍

蔡亮?，張凌華，楊子杰，裘麗珍

復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，上海 200433

癌癥，因癌細胞的內(nèi)源性、異質(zhì)性和突變抗藥性而難以治愈，被稱為“不可逆轉(zhuǎn)的細胞損傷”。目前癌癥治療的常規(guī)方法包括手術(shù)、放療和化療，都不能達到徹底治愈的效果。同時，放療和化療都會對機體的正常細胞，尤其是生長分裂旺盛的細胞，如造血干細胞造成損傷。癌癥干細胞(cancer stem cell，CSC)的存在，也給術(shù)后的復(fù)發(fā)增添了風(fēng)險。作為一種針對人體免疫系統(tǒng)而非針對腫瘤的療法，癌癥免疫療法(cancer immunotherapy)近年來取得的一系列突破性成果得到了廣泛的關(guān)注。

背景：癌癥免疫療法與T細胞的免疫檢查點共信號機制

在詳細說明癌癥免疫療法的原理以及嵌合抗原受體T細胞免疫療法(chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T)技術(shù)的發(fā)展之前，需要闡明T細胞的免疫檢查點共信號機制。

T細胞的激活依靠“雙信號”進行精確調(diào)控。一個特異性激活信號是主要組織相容性復(fù)合體(MHC)和T細胞受體(TCR)的結(jié)合，另一個則是來自共刺激信號受體CD28、CD134(OX40)或CD137 (4-1BB)的刺激信號，或者是來自共抑制信號受體CTLA4或PD-1的抑制信號。如果把共刺激信號比作汽車的“油門”，共抑制信號就好比是“剎車”。T細胞的免疫檢查點就是一類抑制性的分子，通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來避免對正常細胞造成破壞，而癌細胞往往利用這一機制來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，如過表達PD-1的配體PD-L1。

癌癥免疫療法主要分為兩類。一類是干預(yù)療法，即開發(fā)免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor)。以共抑制信號受體CTLA4、PD-1或PD-1的配體PD-L1為靶標設(shè)計抗體，再將抗體注射到病人體內(nèi)。已經(jīng)被FDA批準的藥物如施貴寶公司的Yervoy (Ipilimumab, anti-CTLA4)，Opdivo (Nivolumab, anti-PD1)和默沙東公司的Keytruda (Pembrolizumab, anti-PD-1)。這一療法通過使T細胞跳過免疫檢查點來增強整個機體免疫系統(tǒng)的殺傷功能，但這種療法的一個缺點是殺傷的特異性不夠高。另一類為細胞療法，即體外激活或改造病人的免疫細胞，再將其回輸入病人體內(nèi)，達到增強免疫功能或特異性識別癌細胞表面抗原，進而清除癌細胞的目的。之前的細胞療法，如淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)療法，細胞因子激活的殺傷細胞(CIK)療法，細胞因子激活的殺傷細胞和樹突狀細胞混合(CIK-DC)療法，由于前述的免疫檢查點共信號機制的存在，即使被激活也會在檢查點被阻斷，不能起到很好的療效。直到CAR-T的出現(xiàn)，細胞療法才取得了突破性進展。

原理：嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)免疫療法

嵌合抗原受體，也稱作人工抗原受體(arti fi cial T cell receptor)。顧名思義，就是一類經(jīng)人工改造，由胞外抗原結(jié)合域、跨膜哉和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域組成，集特異性識別靶向腫瘤抗原和激活T細胞兩種作用于一身的T細胞受體。胞外抗原結(jié)合域通常來源于單克隆抗體的單鏈抗體(single-chain variable fragment，scFv)，胞內(nèi)信號域為免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，通常為CD3ζ或FcεRIγ。由于CD3ζ含有3個ITAM，相比于只含有1個ITAM的FcεRIγ能更有效地激活T細胞，所以把CD3ζ作為胞內(nèi)域的CAR更常見。CAR-T技術(shù)現(xiàn)已發(fā)展了三代。第一代CAR在胞內(nèi)只有一個CD3ζ的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域，由于沒有共刺激信號域(costimulatory domain)，不能使T細胞完全活化，無法達到理想的臨床效果。在此基礎(chǔ)上，第二代CAR的胞內(nèi)域引入了1個共刺激信號受體CD28的胞內(nèi)信號域。第三代則增加到2個共刺激信號域，在CD28胞內(nèi)信號域的基礎(chǔ)上又引入CD134或CD137的胞內(nèi)信號域。來自CD28和TCR的激活信號足以使T細胞產(chǎn)生多種白介素，尤其是IL-6。目前，用于臨床的主要為第二代CAR-T技術(shù)(圖1)。

CAR-T臨床治療，作為前述的癌癥免疫的細胞療法，需要從癌癥患者身上分離T細胞，通過轉(zhuǎn)染使患者的T細胞穩(wěn)定表達CAR-T，并在體外大量擴增CAR-T細胞，最后將擴增好的CAR-T細胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。

圖1 第二代嵌合抗原受體(CAR)結(jié)構(gòu)示意圖(圖片來源：https://junotherapeutics com/our-science/car-technology/)

與傳統(tǒng)的T細胞識別抗原相比，CAR識別腫瘤抗原繞過了抗原提呈階段，無需MHC的限制。同時CAR擁有增加的共刺激信號來增強T細胞對腫瘤的殺傷性，因此CAR-T可以克服腫瘤細胞下調(diào)MHC、減少共刺激信號分子表達等免疫逃逸機制對機體免疫系統(tǒng)帶來的不利條件。抗體通常在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)失去效力，然而CAR-T細胞則有望在體內(nèi)循環(huán)數(shù)年，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)。

應(yīng)用：CAR-T，血癌病人絕處逢生

目前CAR-T的臨床應(yīng)用主要集中于血系腫瘤上。已有47項CAR-T臨床研究報道了在血系腫瘤中的實驗結(jié)果，其中對于B細胞惡性腫瘤的療效顯著。2014年發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，在30例不同類型的B細胞惡性腫瘤的CAR-T治療中，27例患者(90%)獲得完全緩解(complete response，CR)，20人(67%)在半年后復(fù)查仍無癌細胞復(fù)發(fā)[1]。然而通常情況下，這些病人的生存期不會超過半年。

不足：CAR-T，并非盡善盡美

筆者將現(xiàn)階段主要的腫瘤治療方法列表進行了比較(表1)。

從中可以看出，CAR-T療法雖然有著對病人創(chuàng)傷較小、治療周期較短等優(yōu)點，但也不是盡善盡美的。作為一種療法，CAR-T的安全性是需要關(guān)注的大問題。目前的第三代CAR-T臨床試驗只有兩年多的時間，對于其是否能治愈癌癥，尚無定論。就目前的CAR-T應(yīng)用來看，這一療法仍存在很多不足之處。

首先從CAR-T原理所涉及的方面考慮，由于CAR-T細胞表達的是一個直接識別腫瘤抗原且具有共激活信號域的受體，它跳過了免疫檢查點的限制，很可能對正常細胞造成非期望的損傷，也就是脫靶效應(yīng)；而且腫瘤特異性抗原目前仍知之甚少，這就限制了CAR-T的臨床應(yīng)用。2010年，研究者采用ERBB2靶向的第三代CAR-T治療一例結(jié)腸癌并伴有肺、肝轉(zhuǎn)移的患者，1010個細胞輸注15 min后，大量CAR-T累積于肺部，攻擊低表達ERBB2的肺上皮細胞，并釋放細胞因子，使患者出現(xiàn)肺水腫癥狀，5天后死亡[4]。

目前CAR-T療法在針對以CD19為靶抗原的B細胞惡性腫瘤等血系腫瘤上取得了令人激動的結(jié)果，而在實體瘤治療方面還沒有理想的療效。早在2006年，全球第一項CAR-T臨床試驗即是針對實體瘤的，目前15項CAR-T治療實體瘤的臨床研究大部分采用的是第一代CAR-T。然而，由于實體瘤免疫抑制的微環(huán)境，免疫細胞不易進入實體瘤內(nèi)部，以及清除實體瘤所需的T細胞數(shù)目遠超過血系腫瘤治療所需，因此CAR-T技術(shù)對于實體瘤的治療還有很長的路要走。

表1 現(xiàn)階段腫瘤療法比較

其次，從CAR-T細胞的整個改造過程考慮，基因載體主要為轉(zhuǎn)染效率高的病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒(AAV)載體。除腺相關(guān)病毒在人體基因組的整合位點可以定向至19號染色體的AAVS位點外，另兩種病毒載體都沒有特異性的位點整合能力，這就可能導(dǎo)致基因的插入突變，或由于插入位置在某一基因的調(diào)控區(qū)而導(dǎo)致該基因的表達水平變化，進而產(chǎn)生不可預(yù)知的后果。

T細胞的體外基因改造會造成T細胞轉(zhuǎn)染后凋亡，使轉(zhuǎn)入的基因不能長期表達。有報道表明，去除CD3ζ的2個ITAM域能夠減少T細胞轉(zhuǎn)染后凋亡[2-3]，但由于1個ITAM域?qū)細胞的激活能力有限，所以目前的改造仍然是使T細胞表達具有3個ITAM域CD3ζ的CAR。然而這樣一來，CAR的表達率也會降低。所以篩選CAR-T的穩(wěn)定株就是一項艱巨的工程，在這之后還需要大量擴增CAR-T至幾十億乃至上百億個克隆以回輸入病人體內(nèi)，以產(chǎn)生明顯的臨床效果。這一過程可謂是“路漫漫其修遠兮”。

再者，從CAR-T的臨床治療階段考慮。大量的CAR-T細胞回輸入病人體內(nèi)，結(jié)合相關(guān)抗原被激活后會產(chǎn)生超量的細胞因子，引發(fā)細胞因子釋放綜合癥(cytokine release syndrome，CRS)，造成高燒不退、心跳過速等癥狀，嚴重者可導(dǎo)致死亡。例如，2014年由美國斯隆-凱特琳癌癥中心主導(dǎo)的一項利用CAR-T治療非霍奇金氏淋巴瘤的早期研究疑因引發(fā)“細胞因子風(fēng)暴”而造成患者死亡。然而，有了一定的臨床經(jīng)驗后，配合使用IL-6受體的抗體Tocilizumab可以使這一副反應(yīng)得到有效控制。

最后，從癌癥免疫療法的適用對象考慮，癌癥免疫療法不適用于有自身免疫疾病和需要使用免疫抑制類藥物的病人，不過此類病人在患者群中并非絕大多數(shù)。

此外，在醫(yī)療過程中還不得不考慮到社會問題。CAR-T療法的一大弱點是費用高，在療效相同的情況下與其他藥物的競爭優(yōu)勢不明顯。由于癌癥免疫的細胞療法需要從病人體內(nèi)分離T細胞并在體外進行基因改造和大量擴增，這一療法實際上可以看作是一種基因治療。因此，CAR-T療法極其昂貴，治療一次的費用為30萬～50萬美元，遠遠超出了普通家庭的承擔(dān)能力。所以，從治療費用的角度看，對于某些疾病如費城染色體陽性急性淋巴細胞白血病，CAR-T療法相比于小分子的靶向治療藥物格列衛(wèi)(Gleevec)并沒有太大優(yōu)勢。

前景：改進CAR-T，使之真正成為利劍

然而，拋開一切社會因素不談，科研工作者的第一要務(wù)是改良CAR-T，抓住一切能夠治愈癌癥的希望。

CAR-T療法的致命弱點有兩個：一是可能會引發(fā)“細胞因子風(fēng)暴”；二是特異性抗原難找。前者通過配合使用IL-6受體的抗Tocilizumab可以被控制，而后者要發(fā)現(xiàn)癌細胞表面特異的抗原，就沒有那么容易。難道我們要等到基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)了這些“新大陸”，再發(fā)展特異性強的CAR-T，讓這幾十年間成千上萬的患者坐以待斃嗎？因此，我們需要把目光重新投到免疫檢查點共信號機制，以此發(fā)掘可能的改進方案。

第二代和第三代CAR-T都采用了免疫共激活分子，沒有利用免疫共抑制分子進行抗原特異性的免疫檢查。設(shè)想同時在腫瘤細胞和正常細胞表面表達的抗原A，和只在正常細胞表面表達的抗原B。如果使T細胞同時表達識別A的CAR和識別B的iCAR，當只有CAR與配體結(jié)合時激活T細胞，當CAR和iCAR都與配體結(jié)合時，iCAR產(chǎn)生抑制信號阻斷CAR的作用，即可提高CAR-T的特異性(圖2)。iCAR有望在對抗實體瘤中發(fā)揮作用。

圖2 針對CAR特異性的改進：iCAR(圖片來源：https://junotherapeutics.com/ourscience/car-technology/)

另一種策略是雙信號平衡機制，需要CAR的活化信號分別在兩個受體上表達。如果抗原A和B同時表達于腫瘤細胞表面，而不同時表達于正常細胞表面，就可通過A和B受體的同時激活使得T細胞活化，而只有A或B受體的激活不能使T細胞活化[5]。

除此之外，提高體外改造T細胞的效率也十分重要。選擇高效、細胞毒性小、能夠定點整合的基因載體，提高T細胞的轉(zhuǎn)染后生存率，以及改造CAR使之能夠在T細胞中高效表達并提高CAR本身的穩(wěn)定性，都是CAR-T這一技術(shù)需要改進的方面。

(2016年2月19日收稿)

[1] MAUDE S L, FREY N, SHAW P A, et al. Chimeric antigen T cells for sustained remissions in leukemia [J]. The New England Journal of Medicine, 2014, 371(16): 1507-1517.

[2] HEUSER C, HOMBACH A, L?SCH C, et al. T-cell activation by recombinant immunore ceptors: Impact of the intracellular signalling domain on the stability of receptor expression and antigen-speciic activation of grafted T cells [J]. Gene Therapy, 2003, 10(17): 1408-1419.

[3] ZHAO Y, WANG Q J, YANG S, et al. A herceptin-based chimeric antigen receptor with modi fi ed signaling domains leads to enhanced survival of transduced T lymphocytes and antitumor activity [J]. The Journal of Immunology, 2009, 183(9): 5563-5574.

[4] PEGRAM H J, PARK J H, BRENTJENS R J. CD28z CARs and armored CARs [J].The Cancer Journal, 2014, 20(2): 127-133.

[5] MORGAN R A, YANG J C, KITANO M, et al. Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizingERBB2 [J]. Molecular Therapy, 2010, 18(4): 843-851.

(編輯：段艷芳)

Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy: A new approach to cancer therapy

CAI Liang, ZHANG Linghua, YANG Zijie，QIU Lizhen
Fudan University, Shanghai 200433, China

10.3969/j.issn.0253-9608.2016.03.011

?通信作者，E-mail: cell@fudan.edu.cn