周麗芬，　林啟旺，　廖　莉，　梁梓明，　陳慶梓，　陳玲玲，　黃佳婷，　李建華△

(廣州醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)學(xué)院，2第三臨床學(xué)院， 廣東 廣州 511436)

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▲并列第1作者

·短篇論著·外源性H2S干預(yù)對O3致哮喘小鼠氣道反應(yīng)性和氣道重塑的影響*

周麗芬1▲，林啟旺2▲，廖莉2，梁梓明2，陳慶梓1，陳玲玲2，黃佳婷2，李建華1△

(廣州醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)學(xué)院，2第三臨床學(xué)院， 廣東 廣州 511436)

[摘要]目的： 探討外源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)對臭氧(ozone，O3)致哮喘小鼠氣道反應(yīng)性和氣道重塑的影響。方法: 將15只SPF級C57BL/6雌性小鼠隨機分為對照組、O3組和NaHS+O3組，每組5只。O3處理前0.5 h，對照組和O3組腹腔注射生理鹽水，NaHS+O3組腹腔注射NaHS(H2S的供體)；O3組和NaHS+O3組隔天用O3處理，對照組則呼吸清潔空氣。持續(xù)4周后無創(chuàng)測定小鼠的氣道反應(yīng)性，隨后進行氣管環(huán)張力測定，通過肺組織HE染色測定支氣管基底膜周徑(Pbm)和管壁總面積(Wat)并標(biāo)準(zhǔn)化衡量氣道重塑程度，并行AB-PAS染色測定肺組織中杯狀上皮細胞的變化情況以進一步評價氣道重塑程度。結(jié)果: 與對照組相比，O3組小鼠的氣道反應(yīng)性顯著增高；NaHS+O3組明顯低于O3組，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。與對照組相比，O3組小鼠在乙酰甲膽堿刺激時的氣管收縮力顯著加大；NaHS+O3組明顯小于O3組。與對照組相比，O3組小鼠的支氣管壁厚度明顯加大；NaHS+O3組顯著小于O3組但仍大于對照組。與對照組相比，O3組小鼠肺組織中杯狀上皮細胞占氣道上皮細胞總面積的百分比顯著上升；NaHS+O3組顯著低于O3組但仍高于對照組。結(jié)論: 外源性H2S對O3所致哮喘的氣道高反應(yīng)性和氣道重塑有緩解與保護作用，有望為臨床藥物治療哮喘提供新靶點。

[關(guān)鍵詞]支氣管哮喘； 硫化氫； 氣道高反應(yīng)性； 氣道重塑； 臭氧

支氣管哮喘(bronchial asthma)是以氣道炎癥、氣道反應(yīng)性增高和氣道重塑為主要特征的慢性呼吸道疾病。大量國內(nèi)外研究表明，臭氧(ozone，O3)作為一種強氧化性空氣污染物，可誘導(dǎo)哮喘發(fā)病與病情加重[1-2]。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是目前發(fā)現(xiàn)的第3個內(nèi)源性氣體信號分子。近年發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘患者血液和肺組織中內(nèi)源性H2S均降低[3]，在雞卵清蛋白致敏的哮喘小鼠研究也觀察到同樣現(xiàn)象，且H2S降低程度和呼氣流量峰值成正比，與肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞成反比，提示內(nèi)源性H2S可能參與哮喘的病理生理過程[4]。本研究通過O3誘導(dǎo)建立小鼠支氣管哮喘模型，以硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)為H2S供體，觀察外源性H2S對哮喘小鼠氣道反應(yīng)性和氣道重塑的影響，旨在進一步明確H2S能否成為臨床治療哮喘的藥物。

材料和方法

1主要實驗試劑及儀器

無創(chuàng)小動物肺功能儀(BUXCO)；臭氧發(fā)生器(廣州海利集團有限公司)；臭氧檢測儀(2B Techno-logies)；NaHS(Sigma)；AB-PAS染液(南京建成)。

2實驗方法

2.1動物分組及模型制備SPF級C57BL/6雌性小鼠15只，6～8周齡，體重18～22 g。采用隨機數(shù)字表將小鼠分為對照組、O3組、NaHS+O3組，每組5只，將小鼠飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。O3暴露前0.5 h，對照組、O3組腹腔注射生理鹽水，NaHS+O3組腹腔注射0.14 μmol/kg的NaHS[5](用生理鹽水溶成1 mmol/L的濃度再注射)；O3組和NaHS+O3組隔天用0.001‰的O3處理3 h，對照組則呼吸清潔空氣，持續(xù)4周[6]。

2.2氣道反應(yīng)性的測定末次O3處理24 h后，使用BUXCO無創(chuàng)小動物肺功能儀檢測C57BL/6小鼠的氣道反應(yīng)性。依次霧化吸入不同濃度(3.12、6.25、12.5、25和50 g/L)的氯化乙酰甲膽堿(methacholine，MCh)，測定相應(yīng)濃度下增強的呼氣間歇(enhanced pause，Penh)值。以吸入生理鹽水(normal saline，NS)時的Penh值為基值，用Penh/NS(MCh 激發(fā)的Penh值/NS激發(fā)的Penh 值×100%)作為氣道反應(yīng)性統(tǒng)計指標(biāo)來評價氣道反應(yīng)性。Penh/NS值越大，氣道反應(yīng)性越高；Penh/NS越小，氣道反應(yīng)性越低。

2.3氣管環(huán)張力的測定解剖小鼠，摘取肺組織后，從頸部腹面正中切開皮膚分離出氣管，自甲狀軟骨下剪取全部氣管放入盛有37 ℃恒溫Krebs-Henseleit液的平皿中，仔細剔除氣管周圍的結(jié)締組織，將氣管剪成3～5 mm左右的氣管環(huán)。將氣管環(huán)置于Krebs-Henseleit液浴槽中，調(diào)節(jié)溫度為37 ℃，同時將支氣管環(huán)上端連至張力換能器，逐次往浴槽加入Mch，使其終濃度分別為10-9、10-8、10-7、10-6和10-5g/L，用BL-420生物機能實驗系統(tǒng)記錄每次收縮產(chǎn)生的張力，每加入1次MCh并完成測量后，用恒溫Krebs-Henseleit沖洗3次，每次沖洗10 min以上，以保證無MCh殘留。

2.4肺組織切片HE染色將上述小鼠左肺下葉置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)制備病理石蠟切片，HE染色后，鏡下觀察各組肺組織結(jié)構(gòu)、炎性浸潤、支氣管壁有無增厚等情況，使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0分別測量支氣管基底膜周徑(bronchial basement membrane circle diameter, Pbm)、支氣管管壁總面積(total area of the wall, Wat)。 并用Pbm將測得的Wat標(biāo)準(zhǔn)化，用Wat/Pbm代表管壁厚度以衡量氣道重塑程度。

2.5肺組織切片AB-PAS染色新鮮肺組織取材后，常規(guī)制備病理石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟后用蒸餾水洗2 min，隨后用阿辛藍(Alcian blue，AB)溶液染色20 min，蒸餾水洗3次。放入1 %高碘酸鈉水溶液氧化10 min，再用過碘酸-雪夫(periodie acid- Schiff，PAS)液避光浸染20 min。傾去Schiff 液，流水沖洗10 min。后用蘇木素染色液染核2 min，再用酸性乙醇分化液分化，蒸餾水洗2 min。用氨水溶液進行返藍，蒸餾水洗3 min，逐級常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。在AB-PAS染色中，黏液物質(zhì)被AB染色呈湖藍色；中性黏液物質(zhì)被PAS染色呈紫藍色。鏡下觀察各組支氣管腔，使用Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)定量分析藍染陽性區(qū)域，并計算分泌黏液的杯狀上皮細胞與氣道上皮細胞數(shù)量比例以進一步評價氣道重塑程度。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。所有計量資料間的比較在確定方差齊性后采用單因素方差分析，以SNK法進行組間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1行為學(xué)觀察

O3處理時，O3組小鼠表現(xiàn)為煩躁不安，呼吸急促，節(jié)律不齊，腹肌痙攣，大小便失禁；持續(xù)的O3應(yīng)激后，部分小鼠出現(xiàn)喘息或哮鳴音。Control組和O3+NaHS組上述現(xiàn)象并不明顯。

2氣道反應(yīng)性的變化

如圖1所示，隨著MCh的濃度增加，Penh/NS逐漸增大；在3.125與6.25 g/L濃度的Mch刺激時，對照組、O3組、O3+NaHS組的Penh/NS兩兩比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；用12.5、25和50 g/L濃度的MCh刺激時，O3組的Penh/NS與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，O3+NaHS組的Penh/NS與O3組相比差異亦有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。結(jié)果表明，O3組的氣道反應(yīng)性顯著高于對照組，但O3+NaHS組的氣道反應(yīng)性明顯低于O3組。

Figure 1.The changes of Penh/NS in the mice with different treatments. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsO3+NaHS group.

圖1各組Penh/NS的變化情況

3氣管收縮張力的變化

如圖2所示，隨著MCh的濃度增加，氣管環(huán)收縮張力加大。在10-8、10-6和10-5g/L終濃度的MCh刺激時，O3組的收縮張力與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；在10-8、10-7、10-6和10-5g/L終濃度的MCh刺激時，O3+NaHS組的收縮張力與O3組對比差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；結(jié)果表明，與對照組相比，O3組小鼠在MCh刺激時的氣管收縮張力顯著加大；NaHS+O3組明顯低于O3組。由此可見，氣道收縮張力的變化與氣道反應(yīng)性大體一致，進一步說明外源性H2S可以降低哮喘小鼠的氣道反應(yīng)性。

Figure 2.The changes of tracheal ring contraction tension stimulated with MCh in each group. Mean ±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsO3+NaHS group.

圖2不同組對不同濃度乙酰甲膽堿刺激后氣管環(huán)收縮張力的變化

4肺組織顯微結(jié)構(gòu)的改變

肺組織HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見炎癥細胞浸潤及平滑肌增生，支氣管壁無改變；O3組小鼠肺組織大量炎癥細胞浸潤，支氣管壁可見增厚，平滑肌細胞肥大增生，支氣管上皮細胞有部分壞死阻塞支氣管腔，肺泡上皮細胞亦可見壞死，氣道重塑現(xiàn)象明顯；NaHS+O3組小鼠可見炎癥細胞數(shù)量較O3組有所減少，氣道壁增厚不明顯，平滑肌細胞無明顯增生，壞死細胞亦減少，氣道重塑現(xiàn)象比O3組有所緩解，見圖3 。

5支氣管壁厚度的變化

Image-Pro Plus 6.0軟件分析結(jié)果顯示，與對照組相比，O3組小鼠的支氣管壁厚度明顯加大(P<0.05)，重塑現(xiàn)象明顯；NaHS+O3組小鼠的支氣管壁厚度顯著小于O3組(P<0.05)，重塑現(xiàn)象有所緩解但與對照組相比支氣管壁仍增厚，見表1。

6氣管腔中黏液與杯狀上皮細胞

肺組織AB-PAS染色結(jié)果顯示，與對照組相比，O3組的氣道上皮細胞表面黏液增多，O3+NaHS組黏液比O3組有所減少。Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析顯示，與對照組相比，O3組小鼠肺組織中杯狀上皮細胞占氣道上皮細胞總面積的百分比顯著上升(P<0.05)；NaHS+O3組顯著低于O3組(P<0.05)但仍高于對照組(P<0.05)。結(jié)果進一步表明，NaHS的干預(yù)可緩解O3所致的氣道重塑現(xiàn)象，見圖3、表1。

Figure 3.The morphological changes of the lung tissues in each group.

圖3不同組的肺組織形態(tài)學(xué)觀察

表1不同組支氣管壁厚度和杯狀上皮細胞占氣道上皮細胞總面積百分比的比較

Table 1.The changes of the bronchial wall thickness and the proportion of goblet epithelial cells in the total area of airway epithelial cells in each group (%. Mean±SD.n=5)

GroupWat/PbmTheproportionofgobletepithelialcellsControl31.74±10.9816±3O372.33±8.43*33±5*O3+NaHS55.39±5.19*#19±3*#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsO3group.

討論

支氣管哮喘已嚴重影響了全球億萬人的健康，其患病率及死亡率逐年增加。預(yù)計到2025年，哮喘患者人數(shù)將有可能達到4億。全球哮喘防治倡議資料2010年發(fā)布了中國大陸、臺灣、香港、澳門等地哮喘人數(shù)為2 780萬，平均臨床哮喘患病率為2.1%。支氣管哮喘導(dǎo)致患者反復(fù)出現(xiàn)喘息和呼吸困難等癥狀，其相關(guān)機制迄今尚未完全闡明[7]。近年環(huán)境中O3濃度逐年增高，已成為誘導(dǎo)哮喘發(fā)病與加重的重要致病因素之一[8]。大量臨床資料與實驗研究表明，O3可以作為一種無抗原性的氧化應(yīng)激因子引起哮喘、慢性阻塞性肺病等一系列呼吸系統(tǒng)疾病[1]。O3能誘導(dǎo)氣道中性粒細胞增高和炎癥細胞浸潤，加劇氣道炎癥程度，從而導(dǎo)致FEV1減少；還會導(dǎo)致氣道過敏性介質(zhì)5-HT生成增多，引起氣道平滑肌張力增加[9]，并且通過氧化應(yīng)激途徑誘發(fā)氣道黏液增多以及Muc5ac等黏蛋白表達，導(dǎo)致肺呼吸功能減弱；另外，O3還通過損傷上皮細胞與神經(jīng)刺激等多個層面的效應(yīng)通路導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增高[4]。綜上研究，O3可能通過上述途徑啟動和促發(fā)氣道炎癥反應(yīng)與重塑，使氣道狹窄，導(dǎo)致哮喘的發(fā)病與加重。本實驗中，我們用0.001‰的O3反復(fù)刺激小鼠建立慢性哮喘模型，可觀察到小鼠肺組織發(fā)生炎癥細胞浸潤，細胞壞死，氣管壁杯狀細胞增殖，氣管壁增厚重塑，氣道反應(yīng)性增高，支氣管環(huán)收縮張力增大，進一步表明O3可以引起氣道損傷，收縮力增大，反應(yīng)性增高等一系列哮喘的癥狀。

H2S是繼NO和CO之后發(fā)現(xiàn)的第3個內(nèi)源性氣體信號分子，主要由氣道和肺組織中的2種H2S生成酶——胱硫醚β合酶和胱硫醚γ合酶產(chǎn)生，對機體病理生理過程具有重要的調(diào)控作用，尤其與哮喘、肺損傷等呼吸疾病密切相關(guān)[10-11]。不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性H2S減少的程度與哮喘的嚴重程度相關(guān)，提出內(nèi)源性H2S的減少可以作為哮喘嚴重度及活動度的重要生物標(biāo)志物[3-4, 12]。黃新莉等[10]使用NaHS作為外源性H2S的供體，觀察到外源性的NaHS能通過下調(diào)細胞間黏附因子1以及抑制核因子κB通路而加快多形核白細胞凋亡，減少炎癥細胞的集聚，起到降低肺損傷的作用；外源性H2S(NaHS)可通過減輕氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、降低小鼠的肺通透性來減輕高氧誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷[13]。在本實驗中，我們提前半小時使用NaHS預(yù)處理O3誘導(dǎo)的慢性哮喘小鼠，觀察到哮喘小鼠肺組織中炎癥細胞浸潤程度減低，氣管壁增厚程度減弱，杯狀細胞增生減少，氣道反應(yīng)性減低，氣管收縮力減少，表明外源性H2S對哮喘炎癥有緩解與治療的積極作用。大量國內(nèi)外研究表明，外源性H2S作為能自由穿透細胞膜的信息分子，能比傳統(tǒng)的抗氧化劑更有效地抑制氧化應(yīng)激、緩解炎癥與降低肺的滲透性，并最終起到減輕肺與氣道損傷、保護支氣管與肺泡生長的作用[4, 14]?？寡趸饔每赡苁峭庠葱訦2S在本實驗中抑制哮喘多種癥狀的原因。

綜上所述，外源性H2S能一定程度減輕哮喘的氣道高反應(yīng)，降低氣管收縮力，減少黏液分泌，緩解氣道重塑，對臭氧導(dǎo)致的哮喘具有保護與緩解的積極作用。但在此實驗中，我們并未從細胞和分子水平闡明外源性H2S緩解治療哮喘的相關(guān)機制與通路，實驗內(nèi)容亦較為有限，接下來將進一步深入研究，以期為臨床哮喘的藥物治療提供新的方向與治療靶點。

[參考文獻]

[1]Kim BJ, Kwon JW, Seo JH, et al. Association of ozone exposure with asthma, allergic rhinitis, and allergic sensitization[J]. Ann Allergy Asthma Immunol, 2011, 107(3):214-219.

[2]Bao A, Liang L, Li F, et al. Effects of acute ozone exposure on lung peak allergic inflammation of mice[J]. Front Biosci (Landmark Ed), 2013, 18:838-851.

[3]伍蕊，姚婉貞，陳亞紅，等. 支氣管哮喘患者血漿中硫化氫的變化及其意義[J]. 北京大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版, 2008, 40(5):505-508.

[4]Chung KF. Hydrogen sulfide as a potential biomarker of asthma[J]. Expert Rev Respir Med, 2014, 8(1):5-13.

[5]Zhang G, Wang P, Yang G, et al. The inhibitory role of hydrogen sulfide in airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma[J]. Am J Pathol, 2013,182(4):1188-1195.

[6]Shore SA, Johnston RA, Schwartzman IN, et al. Ozone-induced airway hyperresponsiveness is reduced in immature mice[J]. J Appl Physiol (1985), 2002, 92(3):1019-1028.

[7]Kim CS, Alexis NE, Rappold AG, et al. Lung function and inflammatory responses in healthy young adults exposed to 0.06 ppm ozone for 6.6 hours[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011, 183(9):1215-1221.

[8]Frampton MW. Ozone air pollution: how low can you go?[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2011,184(2):150-151.

[9]Moore BD, Hyde D, Miller L, et al. Allergen and ozone exacerbate serotonin-induced increases in airway smooth muscle contraction in a model of childhood asthma[J]. Respiration, 2012, 83(6):529-542.

[10]黃新莉, 馬會杰, 周曉紅，等. 外源性硫化氫對大鼠內(nèi)毒素性肺損傷的影響及機制研究[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2010,26(4):477-480.

[11]Chen YH, Yao WZ, Gao JZ, et al. Serum hydrogen sulfide as a novel marker predicting bacterial involvement in patients with community-acquired lower respiratory tract infections[J]. Respirology, 2009, 14(5):746-752.

[12]Chen YH, Wu R, Geng B, et al. Endogenous hydrogen sulfide reduces airway inflammation and remodeling in a rat model of asthma[J]. Cytokine, 2009, 45(2):117-123.

[13]Li HD, Zhang ZR, Zhang QX, et al. Treatment with exogenous hydrogen sulfide attenuates hyperoxia-induced acute lung injury in mice[J]. Eur J Appl Physiol, 2013, 113(6):1555-1563.

[14]Wang P, Zhang G, Wondimu T, et al. Hydrogen sulfide and asthma[J]. Exp Physiol, 2011, 96(9):847-852.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of exogenous H2S on O3-induced airway hyperresponsiveness and airway remodeling in a mouse model of asthmaZHOU Li-fen1, LIN Qi-wang2, LIAO Li2, LIANG Zi-ming2, CHEN Qing-zi1, CHEN Ling-ling2, HUANG Jia-ting2, LI Jian hua1

(1DepartmentofBasicScience,2TheThirdClinicalDepartment,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China.E-mail:lijianh@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of exogenous hydrogen sulfide (H2S) on ozone (O3)-induced airway hyperresponsiveness and airway remodeling in a mouse model of asthma. METHODS: Female SPF C57BL/6 mice were randomized as control group, O3group and NaHS+O3group. Half an hour before O3treatment, the mice in control group and O3group were intraperitoneally injected with normal saline, while the mice in NaHS+O3group were intraperitoneally injected with NaHS (H2S donor); then the mice in O3and NaHS+O3group were treated with O3, while the mice in control group breathed clean air. After 4 weeks, the airway responsiveness and tracheal ring tension were measured. The bronchial basement membrane circle diameter (Pbm) and the total area of the wall (Wat) were determined with HE staining and standardized to measure airway remodeling. The changes of goblet epithelial cells in the lung tissue were determined with AB-PAS staining. RESULTS: Airway tension of O3group was significantly higher than that in control group, but that in NaHS+O3group was obviously lower than that in O3group and had no significant difference compared with control group. Compared with control group, the tension of tracheal ring stimulated by methacholine in O3group increased significantly, but that in NaHS+O3group decreased obviously compared with O3group and had no significant change compared with control group. Compared with control group, bronchial wall thickness in O3group increased significantly, but that in NaHS+O3group decreased obviously compared with O3group and increased significantly compared with control group. Compared with control group, goblet epithelial cell proportion in the total area of airway epithelial cells in O3group increased significantly, but that in NaHS+O3group decreased compared with O3group and increased significantly compared with control group. CONCLUSION: Exogenous H2S reduces O3-induced airway hyperresponsiveness and airway remodeling, thus providing a new target for clinical drug treatment of asthma.

[KEY WORDS]Asthma; Hydrogen sulfide; Airway hyperresponsiveness; Airway remodeling; Ozone

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.026

[中圖分類號]R363

[文獻標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 020-37103061; E-mail: lijianh@hotmail.com

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81470205); 廣州市屬高校科研計劃重點項目(No. 2012C043); 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項目(No. A2015157); 廣州醫(yī)科大學(xué)青年科研項目(No. 2014A01); 2014年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃

[收稿日期]2015- 09- 02[修回日期] 2015- 11- 05

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0347- 05