劉曉燕，　劉紅云，　高延民，　謝雙鋒，　羅先明，　常建星，　徐　康，　馬麗萍△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1血液內(nèi)科，2普外科，廣東 廣州 510120)

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B族鏈球菌不同菌株對(duì)血小板的活化作用*

劉曉燕1，劉紅云1，高延民1，謝雙鋒1，羅先明1，常建星2，徐康2，馬麗萍1△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1血液內(nèi)科，2普外科，廣東 廣州 510120)

[摘要]目的： 探索B族鏈球菌(GBS)不同菌株對(duì)血小板活化的作用及可能的機(jī)制。方法: 來自膿毒癥伴血小板減少患者分離鑒定的6株GBS作為誘導(dǎo)劑，分別采用血小板聚集儀、流式細(xì)胞術(shù)、掃描電鏡和Western blotting方法檢測(cè)它們對(duì)血小板聚集率以及血小板膜蛋白CD62P、TLR2和TLR4表達(dá)的影響；進(jìn)一步用TLR2和TLR4單克隆抗體封閉血小板表面TLR2和TLR4以檢測(cè)它們與GBS誘導(dǎo)的血小板活化的關(guān)系。結(jié)果: 6株GBS中有3株可誘導(dǎo)血小板聚集，且能明顯上調(diào)血小板TLR2和CD62P的表達(dá)(P<0.05)，但對(duì)血小板TLR4的表達(dá)沒有影響；封閉血小板TLR2后，GBS誘導(dǎo)的血小板聚集率明顯下降。結(jié)論: 部分GBS菌株可誘導(dǎo)血小板活化，血小板TLR2可能在這個(gè)過程中起重要作用。

[關(guān)鍵詞]B族鏈球菌； 血小板活化； 膿毒癥； Toll樣受體

臨床上，嚴(yán)重感染患者常合并血小板減少，重者發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)[1-3]，血小板在其中發(fā)揮重要作用。血小板-細(xì)菌、血小板-粒細(xì)胞及血小板-內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用，直接或間接地參與炎癥反應(yīng)和上述過程[4]，目前有學(xué)者提出血小板也是一種免疫細(xì)胞[5-6]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是介導(dǎo)機(jī)體抗感染免疫的主要蛋白，也表達(dá)在血小板上，成為血小板參與炎癥反應(yīng)和監(jiān)測(cè)感染的證據(jù)之一[7-9]。已有研究顯示細(xì)菌可以誘導(dǎo)血小板活化，但由于細(xì)菌菌株的不同，活化血小板的機(jī)制也不盡相同，血小板TLRs是否參與少見報(bào)道。本研究選擇從膿毒癥伴血小板減少患者中分離出的6株B族鏈球菌(Group B streptococcus，GBS)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探索GBS和血小板作用的可能機(jī)制。

材料和方法

1主要儀器與試劑

血平板培養(yǎng)基及BHI培養(yǎng)基分別購(gòu)自廣州環(huán)凱及廣州齊云公司；血小板誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)購(gòu)自Chrono-log；封閉性單克隆抗體TLR2(clone TL2.1)和TLR4(HTA125)分別購(gòu)自Invitrogen和Novus；多克隆抗體兔抗人TLR2、兔抗鼠TLR4和兔抗人β-actin購(gòu)自Abcam；用于流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的相關(guān)抗體如CD62P-PE、CD61-PerCP以及同型對(duì)照抗體購(gòu)自Becton Deckinson；牛血清蛋白購(gòu)自申能博彩公司；所有的RT-PCR相關(guān)試劑購(gòu)自TaKaRa。

2主要方法

2.1GBS標(biāo)本來源及其培養(yǎng)6株GBS菌株來源于中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院檢驗(yàn)科的臨床標(biāo)本(患者均為膿毒癥且伴有血小板減少)，經(jīng)分離和鑒定后的編號(hào)為255、639、945、81875、90604和93555。用劃線培養(yǎng)法將GBS凍干粉接種至固體血平板培養(yǎng)基，37 ℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h后，取菌革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體形態(tài)確定無雜菌生長(zhǎng)后接種到BHI液體培養(yǎng)基，置于搖床中培養(yǎng)18～24 h后收獲細(xì)菌。收獲的細(xì)菌液在4 ℃、1 500 r/min離心15 min，棄上清，菌體用PBS洗滌2次。

2.2富血小板血漿和血小板懸液的制備健康獻(xiàn)血員(25～52歲)，性別不限，無長(zhǎng)期使用避孕藥及吸煙史。抽血30 d內(nèi)未服用抗血小板藥物。3.8%枸櫞酸鈉抗凝管抽取全血后1 000 r/min離心10 min，獲取上層富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，剩余血3 000 r/min離心10 min后獲取乏血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)。

2.3血小板聚集率的測(cè)定用北京普利生LBY-NJ4 聚集儀行比濁法分別檢測(cè)不同誘導(dǎo)劑(6種菌液、ADP和生理鹽水)誘導(dǎo)的血小板聚集率，ADP和生理鹽水分別為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，觀察時(shí)間為20 min。在抗體阻斷實(shí)驗(yàn)中，將PRP 300 μL預(yù)先與抗TLR2(10 mg/L)或抗TLR4(10 mg/L)抗體在37 ℃下孵育30 min，后加入上述菌液各10 μL，檢測(cè)血小板聚集率。

2.4血小板膜表面蛋白的測(cè)定流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板膜表面蛋白CD62P的表達(dá)。分別取6種菌液和生理鹽水各50 μL，與PRP 200 μL混合，37 ℃靜置30 min。取10 μL處理后的PRP，分別加入單克隆抗體PE-CD62P、PerCP-CD61以及同型對(duì)照10 μL，避光孵育20 min后，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板CD62P的陽(yáng)性百分比，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5掃描電鏡實(shí)驗(yàn)用GBS 639包被培養(yǎng)皿，加入血小板懸液后分別孵育10 min、20 min和30 min。PBS洗滌1次去除未黏附的血小板，乙醇濃度梯度(30%、50%、70%、90%、100%)脫水，丙酮置換后電鍍膜，掃描電鏡下觀察血小板與GBS的相互作用。

2.6Western blotting法檢測(cè)血小板總TLR2/TLR4蛋白的水平將獲得的血小板沉淀按照100∶10∶1的比例加入RIPA、磷酸酶抑制劑和PMSF后,冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心30 min獲得上層清亮蛋白質(zhì)溶液。按照碧云天BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書測(cè)各組蛋白濃度。然后進(jìn)行蛋白質(zhì)SDS-PAGE，最后ECL發(fā)光鑒定。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布及方差齊性的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；組間比較采用單因素方差分析，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的多重比較采用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1GBS體外誘導(dǎo)血小板聚集

ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率為(61.43±2.94)%；與陰性對(duì)照組(生理鹽水)比較，6株GBS中，只有639、81875及90604菌株能誘導(dǎo)血小板聚集(P<0.05)，分別是(57.08±3.89)%、(42.13±3.78)%及(45.88±3.08)%。639菌株誘導(dǎo)血小板聚集的能力與ADP相當(dāng)，較81875及90604菌株強(qiáng)(P<0.01)，后兩者之間對(duì)血小板聚集能力相當(dāng)，見圖1A。

與陽(yáng)性對(duì)照組ADP誘導(dǎo)的血小板聚集觸發(fā)時(shí)間為0 s相比，不同GBS菌株誘導(dǎo)血小板聚集的觸發(fā)時(shí)間則比較滯后，其中639菌株為(147.00±13.66) s，81875菌株為(199.10±10.30) s，90604菌株為(88.70±9.60) s。255、945和93555菌株在本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間內(nèi)(20 min，圖1B中只標(biāo)注到10 min)未檢測(cè)到血小板聚集。每株GBS誘導(dǎo)不同獻(xiàn)血者血小板聚集的觸發(fā)時(shí)間及聚集率之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1B。

Figure 1.Platelet aggregation in response to GBS. A: the effect of 6 GBS strains on platelet aggregation; B: the lag time of different strains. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS；▲▲P<0.01vs639;#P<0.05vsADP.

圖1GBS誘導(dǎo)的血小板聚集

2GBS上調(diào)血小板CD62P的表達(dá)

陰性對(duì)照生理鹽水(NS)組血小板CD62P陽(yáng)性百分比為(4.62±0.28)%。6株GBS中，只有639、81875及90604菌株能明顯上調(diào)血小板CD62P表達(dá)(P<0.05)，CD62P陽(yáng)性百分比為分別是(46.98±7.63)%、(15.78±5.76)%和(11.68±2.53)%。639菌株上調(diào)血小板CD62P的能力高于81875及90604菌株(P<0.01)，后兩者之間無顯著差異，見圖 2。

Figure 2.Three GBS strains up-regulated the expression of platelet CD62P. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsNS;▲▲P<0.01vsGBS 639.

圖26株菌和NS誘導(dǎo)的血小板CD62P的表達(dá)

3掃描電鏡觀察血小板與GBS相互作用

通過掃描電鏡觀察到GBS和血小板相互作用后血小板形態(tài)的變化(變形、伸出偽足)、聚集以及與GBS的黏附，最終形成血小板凝塊，見圖3。

Figure 3.The interaction of platelets with GBS 639. A: the stationary platelets; B: the platelets were activated by the bacteria and stretched out the parapodium (10 min); C, D: the platelet aggregation.

圖3血小板與GBS的相互作用

4GBS對(duì)血小板TLR2/TLR4的影響

以β-actin為內(nèi)參照，Western blotting檢測(cè)GBS刺激血小板后TLR2和TLR4蛋白的表達(dá)水平。NS組血小板TLR2 蛋白的表達(dá)是0.347±0.048，639、81875及90604菌株刺激血小板后，血小板TLR2 蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，分別是0.906±0.048、0.853±0.027及0.913±0.017，各組間無明顯差異。但是GBS菌株刺激血小板后，TLR4 蛋白的表達(dá)未見明顯變化，見圖4。

Figure 4.The expression of TLR2 and TLR4 in the platelets interacted with bacteria detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNS.

圖4GBS菌株對(duì)血小板TLR2/4表達(dá)的影響

5抗TLR2/TLR4抗體封閉血小板TLR2/TLR4后的血小板聚集率

為了證明血小板TLRs參與GBS誘導(dǎo)的血小板活化，將抗TLR2抗體或抗TLR4抗體預(yù)先與血小板懸液孵育后再檢測(cè)GBS對(duì)血小板聚集率的作用。未封閉前，639、81875及90604菌株誘導(dǎo)的血小板聚集率分別是(57.08±3.89)%、(42.13±3.78)%及(45.88±3.08)%；抗TLR2抗體封閉后，3株GBS誘導(dǎo)的血小板聚集率分別是(5.70±1.73)%、(2.40±0.96)%及(2.80±1.78)%，均較封閉前明顯下降(P<0.05)；抗TLR4抗體封閉TLR4活性后，3株GBS誘導(dǎo)的血小板聚集率分別是(54.84±5.70)%、(45.54±2.90)%及(43.38±4.20)%，較封閉前無明顯變化，見圖5。

Figure 5.GBS-induced platelet aggregation in a TLR2-dependent manner. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol.

圖5抗TLR2/TLR4抗體封閉前后，GBS誘導(dǎo)的血小板聚集率

討論

盡管炎癥介質(zhì)、白細(xì)胞及細(xì)菌在感染相關(guān)性血小板減少中的研究有一些進(jìn)展，但細(xì)菌與血小板相互作用的具體機(jī)制并未闡明[10]。早在1987年，Usui等[11]就報(bào)道部分GBS菌株在體外可以誘導(dǎo)血小板聚集，但沒有對(duì)細(xì)菌是如何與血小板相互作用進(jìn)行更深入的解釋。透光率比濁法檢測(cè)的血小板聚集率被認(rèn)為是血小板活化功能檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其原理是檢測(cè)富血小板血漿在各種激動(dòng)劑刺激下發(fā)生血小板聚集或形成血凝塊后透光率的變化。CD62P(P-選擇素)是血小板α顆粒內(nèi)的膜糖蛋白，靜止期血小板不表達(dá)或少量表達(dá)，當(dāng)血小板活化時(shí)暴露于血小板膜表面，因此CD62P被認(rèn)為是反映血小板活化狀態(tài)的敏感指標(biāo)[12]。血小板聚集功能和CD62P是目前檢測(cè)血小板活化中應(yīng)用最多、也相對(duì)穩(wěn)定的指標(biāo)[13]。因此本文選擇這2項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行GBS誘導(dǎo)血小板活化的實(shí)驗(yàn)。

首先我們對(duì)來自臨床膿毒癥患者的GBS菌株進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)僅有3株細(xì)菌能誘導(dǎo)血小板聚集，且不同菌株引起血小板聚集的時(shí)間有先后，所引起的最大聚集率也不同，說明GBS誘導(dǎo)的血小板聚集具有菌株特異性。同時(shí)檢測(cè)的血小板CD62P的表達(dá)結(jié)果與血小板聚集率一致，呈促進(jìn)作用，而且程度不同，在3株中以GBS 639上調(diào)血小板CD62P的能力最強(qiáng)，說明GBS具有誘導(dǎo)血小板活化的作用。然而，血小板本身是如何識(shí)別GBS菌株從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能改變，是本研究的重點(diǎn)。

血小板膜TLRs作為模式識(shí)別受體，通過識(shí)別病原體上的某些特殊配體，繼而激活下游級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，在宿主抗感染防御免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14-15]。目前被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于血小板的TLRs主要包括TLR1～4、TLR6、TLR7 和 TLR9[15]。TLR4是細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的配體，LPS通過TLR4途徑刺激血小板釋放細(xì)胞因子TNF-α、PMPs及陽(yáng)離子抗菌肽，參與血小板對(duì)微生物的監(jiān)測(cè)及殺傷[16]。Andonegui等[17]曾報(bào)道血小板通過TLR4識(shí)別病原體介導(dǎo)血小板產(chǎn)生活化和釋放反應(yīng)可能是膿毒癥發(fā)生血小板減少和炎癥放大反應(yīng)的機(jī)制。也有研究顯示血小板TLR2同樣能增加血小板表面P-選擇素和整合蛋白IIb/IIIa的表達(dá)，同時(shí)還產(chǎn)生活性氧，促進(jìn)血液中血小板-粒細(xì)胞的聚集[8]。GBS誘導(dǎo)血小板活化是否也有可能是該途徑。在本研究中，我們檢測(cè)了GBS刺激后血小板TLR2和TLR4的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血小板TLR2表達(dá)明顯增高，但是血小板TLR4表達(dá)無明顯變化。為了進(jìn)一步明確血小板TLR2/TLR4表達(dá)的功能性，在GBS孵育血小板之前，應(yīng)用抗TLR2/TLR4單克隆抗體預(yù)先封閉血小板表面TLR2/TLR4，與不加抗TLR2/TLR4單抗的富血小板血漿比較血小板聚集率的變化。結(jié)果顯示封閉TLR2能明顯降低GBS誘導(dǎo)的血小板聚集率，而封閉TLR4并不影響GBS誘導(dǎo)的血小板聚集率，提示GBS誘導(dǎo)的血小板聚集率是通過血小板TLR2介導(dǎo)的，而不是TLR4。也就是說GBS被血小板TLR2識(shí)別后誘導(dǎo)了血小板的活化過程。類似的研究見于人巨細(xì)胞病毒[18]。

關(guān)于細(xì)菌本身是哪些成分參與識(shí)別血小板TLR2或其它蛋白，之前在其它標(biāo)準(zhǔn)野生鏈球菌菌株中有報(bào)道，如格氏鏈球菌通過其表面GspB和Hsa蛋白結(jié)合血小板GPIb受體[19]，血鏈球菌通過其表面SrpA蛋白參與血小板黏附[20]。而GBS菌株是否通過其表面蛋白以及通過哪種蛋白活化血小板的具體機(jī)制不詳，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上研究，部分GBS菌株可以誘導(dǎo)血小板活化，而血小板表面TLR2可能是血小板識(shí)別GBS的關(guān)鍵受體，是血小板參與抗感染免疫的有力證據(jù)。我們將對(duì)GBS和血小板TLR2結(jié)合的方式或結(jié)構(gòu)域以及TLR2通路進(jìn)行更深入的探究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of different group B streptococci strains on platelet activationLIU Xiao-yan1, LIU Hong-yun1, GAO Yan-min1, XIE Shuang-feng1, LUO Xian-ming1, CHANG Jian-xing2, XU Kang2, MA Li-ping1

(1DepartmentofHematology,2DepartmentofGeneralSurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:mlp215@aliyun.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the ability of different group B streptococci (GBS) strains on inducing platelet activation. METHODS: Six strains of GBS, separated from the septic patients with thrombocytopenia, were used as the inducers. Light transmission aggregometry was used to measure platelet aggregation. Scanning electron microscopy (SEM) was performed to investigate the interaction of platelets with bacteria. The expression of platelet CD62P, Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 was determined by flow cytometry and Western blotting. Furthermore, the activity of platelet TLR2 (or TLR4) was blocked by anti-TLR2 (or anti-TLR4) monoclonal antibody, and the platelet aggregation induced by GBS was detected. RESULTS: Only 3 of 6 GBS strains isolated from the septic patients induced platelet aggregation and up-regulated the expression of CD62P and TLR2 in the platelets (P<0.05), but not TLR4. Incubation with anti-TLR2 antibody, but not anti-TLR4 antibody, significantly blocked platelet aggregation induced by GBS.CONCLUSION: Some GBS strains from the patients are able to trigger platelet activationinvitro, and platelet TLR2 may play an important role in the interaction between GBS and platelets.

[KEY WORDS]Group B streptococci; Platelet activation; Sepsis; Toll-like receptors

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.024

[中圖分類號(hào)]R363; R515.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 020-81332486; E-mail: mlp215@aliyun.com

*[基金項(xiàng)目]廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. S2013010015539)

[收稿日期]2015- 07- 16[修回日期] 2015- 10- 14

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)02- 0333- 06