鐘長(zhǎng)江, 岳喜磊#, 李建華, 許繼德, 成 瑩, 楊春濤
(廣州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室,廣東 廣州 511436)
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▲并列第1 作者
TRPC1在TGF-β1誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞遷移中的作用*
鐘長(zhǎng)江▲,岳喜磊▲#,李建華,許繼德△,成瑩,楊春濤
(廣州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室,廣東 廣州 511436)
[摘要]目的: 探究經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道1(TRPC1)在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)遷移中的作用。方法: siRNA沉默TRPC1; CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡; 細(xì)胞劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲。Western blot檢測(cè)E-鈣黏蛋白和vimentin的蛋白表達(dá)。結(jié)果: TGF-β1刺激細(xì)胞后,TGF-β1組細(xì)胞的遷移距離大于對(duì)照組(P<0.01)。TGF-β1組和TRPC1沉默組的細(xì)胞活力和凋亡與對(duì)照組相比差異不顯著;與TGF-β1組細(xì)胞比較,siRNA和 TGF-β1 共同作用組遷移能力明顯降低(P<0.01)。與 TGF-β1 組相比,siRNA沉默TRPC1和 TGF-β1 共同作用組E-鈣黏蛋白的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),而vimentin的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論: TRPC1通過調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白和vimentin 的蛋白表達(dá)參與了TGF-β1誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞遷移的過程。
[關(guān)鍵詞]轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1; 人支氣管上皮細(xì)胞; 細(xì)胞遷移; 瞬時(shí)受體電位通道1
支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組份參與的呼吸系統(tǒng)常見慢性多發(fā)病。氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑是其主要三大病理特征,而其中氣道重塑是和哮喘嚴(yán)重程度關(guān)系最為密切的因素[1]。氣道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的改變,包括上皮細(xì)胞脫落和纖毛缺失、細(xì)胞之間的緊密連接和黏附連接破壞以及上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(epithelial to mesenchymal transition,EMT),為氣道重塑的重要標(biāo)志。EMT可促使上皮型細(xì)胞失去細(xì)胞極性,失去與基底膜的連接等上皮表型,從而使上皮細(xì)胞獲得較高的遷移、侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)等間質(zhì)細(xì)胞的能力。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、分化和轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子,參與組織的纖維化、自身免疫性疾病和腫瘤的形成。研究證實(shí),TGF-β1作為一種細(xì)胞外的生長(zhǎng)因子,能在多種生理和病理?xiàng)l件下誘導(dǎo)EMT的發(fā)生,促使上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,進(jìn)而獲得遷移和侵襲能力[2]。細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)特殊的第二信使與細(xì)胞遷移和侵襲等多種生理病理過程密切相關(guān)。經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential channel,TRPC)是非選擇性陽離子通道,參與各種細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流,特別是TRPC1參與形成鈣庫操縱性Ca2+內(nèi)流(store-operated Ca2+entry,SOCE),調(diào)節(jié)Ca2+濃度從而影響細(xì)胞的功能。有研究報(bào)道TGF-β1通過增加TRPC的表達(dá)調(diào)節(jié)胞外Ca2+的內(nèi)流[3],但在TGF-β1誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲過程中是否有TRPC1的參與尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究TRPC1通道是否參與TGF-β1誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞遷移和侵襲的發(fā)生和有關(guān)機(jī)制,為哮喘預(yù)防和臨床治療提供新的靶點(diǎn)。
材料和方法
1材料
1.1細(xì)胞系人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心保存和復(fù)蘇。
1.2主要試劑胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)和1640培養(yǎng)基購自Gibco;重組人TGF-β1購自R&D;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和E-鈣黏蛋白抗體購自CST;vimentin多克隆抗體購自Abcam;Transwell共培養(yǎng)小室購自Corning;CCK-8試劑盒購自日本Dojindo;β-actin抗體和ECL試劑盒購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司;TRPC1基因的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)序列由上海吉瑪公司合成,正義鏈為5’-CCACCUGUAAGAA-GAUAAUTT-3’,反義鏈為5’-AUUAUCUUCUUACAGGUGGTT-3’。
2方法
2.1細(xì)胞培養(yǎng)10% FBS體外培養(yǎng)16HBE細(xì)胞,置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2.2細(xì)胞分組(1)正常對(duì)照組,1% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;(2)10 μg/L TGF-β1處理細(xì)胞組;(3)si-TRPC1單獨(dú)處理細(xì)胞組;(4)si-TRPC1+10 μg/L TGF-β1組。
2.3CCK-8 法檢測(cè)16HBE細(xì)胞的活力將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按每孔5×103個(gè)密度種于96孔板,實(shí)驗(yàn)分組同上,各設(shè)復(fù)孔,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。分別于12 h、24 h 和 48 h 后加入 CCK-8 試劑繼續(xù)孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm吸光度(A)值。
2.4流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況收集各組培養(yǎng)液(其中包含懸浮的死細(xì)胞),用胰酶消化細(xì)胞,用移液管將細(xì)胞吹散。將 5×105細(xì)胞重懸于100 μL binding buffer 中,加入 8~10 μL Annexin V-FITC 試劑,混勻,避光室溫反應(yīng) 10~15 min,補(bǔ)加binding buffer至400 μL;流式細(xì)胞儀上機(jī)前新鮮加入 5 μL (50 mg/L) PI后測(cè)定,激光光波波長(zhǎng)為488 nm,發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630 nm,產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。
2.5遷移能力檢測(cè)(1)劃痕實(shí)驗(yàn):取第3代細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞融合度達(dá)到100%后,用消毒后的200 μL槍頭在6孔板中劃出3~5條無細(xì)胞的傷痕,用PBS清洗漂浮的細(xì)胞后加入按上述分組方式分組的完全培養(yǎng)基,于12 h、24 h和48 h后顯微鏡拍照。(2)Transwell小室實(shí)驗(yàn):采用24孔Transwell小室(8.0 μm)。Transwell小室底部預(yù)先用40 μL的1∶5稀釋基質(zhì)Matrigel膠包被。分組同前,用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè),將200 μL的各組細(xì)胞懸液加入到上室中,同時(shí)下室加入500 μL的含有10% FBS的1640培養(yǎng)基,24 h后取出,PBS洗滌以4%多聚甲醛固定30 min,棉簽擦去上室未遷移的細(xì)胞。自然風(fēng)干后用結(jié)晶紫染色30 min,倒置顯微鏡下觀察5個(gè)視野中遷移至聚碳酸酯微孔膜下表面的細(xì)胞數(shù)。
2.6Western blot實(shí)驗(yàn)將處理后的細(xì)胞用PBS洗滌后提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度后按每孔30 μg上樣,10% SDS-PAGE分離蛋白,恒流280 mA,2 h轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉1 h,分別與抗E-cadherin、vimentin抗體和β-actin抗體4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后 II 抗室溫孵育1 h,洗滌后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。
3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料間的比較在確定方差齊后采用單因素方差分析(one-way ANOVA),各組間的多重比較采用SNK-q檢驗(yàn);如果方差不齊則采用 Welch 法,組間多重比較采用 Dunnett’s T3 檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果
1TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生遷移
用TGF-β1(10 μg/L)刺激16HBE細(xì)胞,與對(duì)照組比較,TGF-β1刺激后,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示16HBE細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng),大量細(xì)胞遷入劃痕區(qū)。隨機(jī)選取每組細(xì)胞3個(gè)區(qū)域測(cè)劃痕寬度和遷移距離進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),TGF-β1作用后遷移距離明顯增加(P<0.01),見圖1。
2siRNA沉默TRPC1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞遷移能力的影響
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,siRNA沉默TRPC1基因24 h,再用TGF-β1刺激細(xì)胞24 h或48 h,由TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移距離明顯受到抑制,與TGF-β1組比較顯著減少(P<0.01),見圖1。
Figure 1.The effect ofTRPC1 silencing on the migration ability of 16HBE cells induced by TGF-β1. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group.
圖1siRNA沉默TRPC1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞遷移能力的影響
3siRNA沉默TRPC1對(duì)細(xì)胞活力的影響
取第3代16HBE細(xì)胞加不同處理因素分別培養(yǎng)12 h、24 h和48 h,結(jié)果顯示TGF-β1組和si-TRPC1組以及si-TRPC1干擾后加TGF-β1處理組細(xì)胞活力與對(duì)照組比較均無顯著差異,見圖2。
4siRNA沉默TRPC1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,與對(duì)照組相比,TGF-β1組和siRNA沉默TRPC1組對(duì)16HBE細(xì)胞凋亡數(shù)目的百分比均無顯著改變,見圖3。
Figure 2.The effect ofTRPC1 silencing on the activity of 16HBE cells induced by TGF-β1. Mean±SD.n=4.
圖2siRNA沉默TRPC1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)16HBE 細(xì)胞活力的影響
Figure 3.The effect ofTRPC1 silencing on the apoptosis of 16HBE cells induced by TGF-β1. Mean±SD.n=4.
圖3siRNA沉默TRPC1對(duì)16HBE 細(xì)胞凋亡的影響
5siRNA沉默TRPC1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞侵襲能力的影響
Transwell實(shí)驗(yàn)中TGF-β1刺激24 h和48 h后,與對(duì)照組比,細(xì)胞遷移穿孔數(shù)量明顯增加(P<0.01);先沉默TRPC1再給TGF-β1刺激后,由TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞穿孔數(shù)目的增加明顯受到抑制,與TGF-β1組比較顯著減少(P<0.01),見圖4。
Figure 4.The effect ofTRPC1 silencing on the invasion ability of 16HBE cells induced by TGF-β1. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group.
圖4siRNA沉默TRPC1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞侵襲能力的影響
6siRNA沉默TRPC1對(duì)E-鈣黏蛋白和vimentin蛋白表達(dá)的影響
Western blot檢測(cè)結(jié)果示,TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞48 h后,E-鈣黏蛋白表達(dá)量明顯降低,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);siRNA沉默TRPC1 24 h再用TGF-β1刺激細(xì)胞48 h,由TGF-β1誘導(dǎo)的E-鈣黏蛋白表達(dá)量的減少受到抑制,與TGF-β1組比較顯著增加(P<0.05),見圖5。
Figure 5.The effect ofTRPC1 silencing on E-cadherin protein expression in 16HBE cells induced by TGF-β1. The relative expression level of E-cadherin protein was normalized to β-actin protein in the same sample. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.
圖5siRNA沉默TRPC1基因?qū)GF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響
TGF-β1作用于16HBE細(xì)胞48 h后,與對(duì)照組相比較,vimentin蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。用siRNA沉默TRPC1 24 h再用TGF-β1刺激細(xì)胞48 h,由TGF-β1誘導(dǎo)的vimentin蛋白表達(dá)量增加受到抑制,與TGF-β1組比較顯著減少(P<0.05),見圖6。
Figure 6.The effect ofTRPC1 silencing on vimentin protein expression in 16HBE cells induced by TGF-β1. The relative expression level of vimentin protein was normalized to β-actin protein in the same sample. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.
圖6siRNA沉默TRPC1基因?qū)GF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞vimentin表達(dá)的影響
討論
支氣管哮喘是由環(huán)境、遺傳及其它因素共同作用而引起的常見的慢性氣道炎癥性疾病,目前經(jīng)典的激素類藥物抗炎和支氣管擴(kuò)張藥平喘治療能緩解哮喘患者的臨床癥狀,控制哮喘的急性發(fā)作,但部分哮喘患者仍出現(xiàn)不同程度的不可逆性氣流阻塞,這被認(rèn)為是由氣道重塑所致。因此,研究氣道重塑方面的機(jī)制對(duì)于哮喘的預(yù)防和治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
在正常狀態(tài)下,氣道上皮受到損傷后,發(fā)生代償性增生反應(yīng),彌補(bǔ)氣道損傷后脫落的細(xì)胞,促進(jìn)氣道上皮的修復(fù)。目前認(rèn)為上皮細(xì)胞受損后可分泌多種細(xì)胞因子如TGF-β1/β2、EGF、ET-1、PDGF等刺激上皮下的成肌纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增生,后2種細(xì)胞亦可分泌多種細(xì)胞因子影響上皮細(xì)胞增殖,它們相互作用最終導(dǎo)致氣道重構(gòu)。TGF-β1是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和遷移的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子,參與組織的纖維化、腫瘤及自身免疫性疾病的形成。同時(shí)TGF-β1對(duì)細(xì)胞增殖有多重效應(yīng),其效應(yīng)細(xì)胞的不同以及TGF-β1應(yīng)用的濃度不同而有差異。如對(duì)于指數(shù)增生期的前列腺基質(zhì)細(xì)胞,TGF-β1可抑制其增殖,其抑制效應(yīng)隨TGF-β1濃度的增加而增強(qiáng)。對(duì)于平頂期的前列腺基質(zhì)細(xì)胞,低濃度(<0.1 μg/L)的TGF-β1表現(xiàn)為刺激增殖作用,而高濃度(>1 μg/L)的TGF-β1無顯著刺激增殖作用。高濃度的TGF-β1可誘使前列腺成纖維細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞的分化,而非促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖。在重癥哮喘患者中,TGF-β1能抑制表皮生長(zhǎng)因子對(duì)氣道上皮細(xì)胞的增殖反應(yīng),從而影響上皮修復(fù)過程。本研究中我們檢測(cè)TGF-β1對(duì)16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)活力影響,發(fā)現(xiàn)給予 10 μg/L TGF-β1細(xì)胞未見明顯增殖,并且我們沉默TRPC1后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞活力未受到沉默TRPC1干擾的影響。
EMT是指在胚胎發(fā)育、組織纖維化或腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)生的上皮細(xì)胞黏附性丟失,轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細(xì)胞而獲得遷移能力的的現(xiàn)象。Zhang等[4]的研究發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞在TGF-β1作用下發(fā)生EMT,參與了氣道重塑和氣道高反應(yīng)性的發(fā)生發(fā)展,進(jìn)而參與哮喘發(fā)病過程。研究發(fā)現(xiàn)組織TGF-β1表達(dá)增加,導(dǎo)致上皮性標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯下降,間質(zhì)性標(biāo)志物vimentin表達(dá)明顯增多,結(jié)果使得細(xì)胞骨架重排,上皮細(xì)胞變得類似于成纖維細(xì)胞,引發(fā)EMT,從而增強(qiáng)了遷移和侵襲能力[5]。EMT發(fā)生過程中,上皮細(xì)胞失去極性,細(xì)胞間黏附喪失,產(chǎn)生細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性結(jié)構(gòu),使細(xì)胞獲得活動(dòng)能力,從而具有侵襲性。研究發(fā)現(xiàn),E-鈣黏蛋白主要表達(dá)于上皮細(xì)胞,它可以通過維持細(xì)胞-細(xì)胞間的連接從而阻止上皮細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲[6]。在大多數(shù)癌組織中E-鈣黏蛋白的表達(dá)及功能都有缺失,而且通過激活E-鈣黏蛋白的表達(dá)可以減少腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在細(xì)胞培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤模型中敲除E-鈣黏蛋白基因可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生和惡性腫瘤的發(fā)展及遷移[7]。上皮細(xì)胞E-鈣黏蛋白的缺失被認(rèn)為是細(xì)胞失去極性和具有遷移能力的重要標(biāo)志。波形蛋白(vimentin)是存在于間充質(zhì)細(xì)胞中的一種中間絲蛋白,表達(dá)于間充質(zhì)細(xì)胞,如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等,它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞黏附分子等蛋白間的相互作用,參與細(xì)胞的遷移、侵襲、黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[8]。Vimentin作為間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志分子表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。Zhao等[9]研究發(fā)現(xiàn),在分化程度低的癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染反義vimentin的載體后,癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞上皮標(biāo)記物E-鈣黏蛋白的蛋白表達(dá)在TGF-β1處理后減少,而間質(zhì)標(biāo)記物vimentin的蛋白表達(dá)在TGF-β1處理后增加,說明TGF-β1能誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。用siRNA沉默TRPC1后,相對(duì)于TGF-β1組,沉默TRPC1后再予TGF-β1刺激細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),由TGF-β1誘導(dǎo)的E-鈣黏蛋白的蛋白表達(dá)減少受到抑制。相反,siRNA沉默TRPC1后由TGF-β1誘導(dǎo)的vimentin蛋白的增加也受到抑制,表明TRPC1可能通過上調(diào)E-鈣黏蛋白和抑制vimentin蛋白表達(dá)參與TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞的遷移。
細(xì)胞遷移是指在外界遷移信號(hào)或趨化物刺激下引發(fā)的細(xì)胞移動(dòng),它是生命活動(dòng)最基本的功能之一,是機(jī)體生理和病理過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。Ca2+作為特殊的第二信使,在調(diào)控細(xì)胞遷移、侵襲、周期、分化和增殖等病理生理過程中起著重要的作用。細(xì)胞膜的鈣庫操縱性鈣通道(store-operated Ca2+channels,SOCC)介導(dǎo)的SOCE是支氣管上皮細(xì)胞等非興奮細(xì)胞產(chǎn)生Ca2+內(nèi)流的主要方式。SOCC由STIM1、Orai1和TRPC家族組成,鈣釋放激活鈣調(diào)節(jié)子1(calcium release-activated calcium modulator 1,CRCM1/Orai1)和TRPC是細(xì)胞膜SOCC的重要組成部分[10]。基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)僅存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,在鈣池消耗后,它作為一種鈣池信號(hào)感受蛋白,感受鈣池充盈狀態(tài)并聚集成斑點(diǎn)向細(xì)胞膜移動(dòng)靠近,并通過N基端與細(xì)胞膜上的SOCC通道(Orai1/TRPC)相互作用而開放鈣通道,形成SOCE[11-12]。Abdullaev等[13]研究發(fā)現(xiàn)沉默內(nèi)皮細(xì)胞TRPC1基因表達(dá)能下調(diào)SOCE,反之,TRPC1蛋白表達(dá)增多,鈣離子內(nèi)流增加,細(xì)胞內(nèi)自由Ca2+濃度升高[14]。TGF-β1作用細(xì)胞后引起的胞漿內(nèi)鈣離子濃度的升高被認(rèn)為是通過STIM1/Orai1激活了SOCC。本課題組已經(jīng)證實(shí)TRPC1在16HBE細(xì)胞上廣泛表達(dá),且TGF-β1作用后TRPC1表達(dá)明顯增加[15],這說明SOCE很可能參與了TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞的EMT,TRPC1在TGF-β1誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞EMT過程中發(fā)揮了重要作用。因此,研究TRPC1通道與氣道上皮細(xì)胞遷移的關(guān)系具有重要的意義和應(yīng)用前景。
為證實(shí)TRPC1通道參與氣道上皮細(xì)胞遷移的作用,本實(shí)驗(yàn)首先用TGF-β1(10 μg/L)作用于16HBE細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞未見活力明顯增加,證實(shí)TGF-β1可以誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生遷移,且不影響細(xì)胞活力。而且也證實(shí)siRNA沉默TRPC1基因?qū)GF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞的凋亡無影響。遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明siRNA沉默TRPC1基因可致TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到抑制。本實(shí)驗(yàn)用siRNA沉默TRPC1基因,觀察到其對(duì)EMT起抑制作用,我們推測(cè)TRPC1可通過參與TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞EMT過程而影響遷移。當(dāng)然,有無其它信號(hào)通路參與這一過程,還有待進(jìn)一步探討。
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(責(zé)任編輯: 陳妙玲, 羅森)
Effects of TRPC1 on TGF-β1-induced migration of human bronchial epithelial cellsZHONG Chang-jiang, YUE Xi-lei, LI Jian-hua, XU Ji-de, CHENG Ying, YANG Chun-tao
(DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China.E-mail:xujide@163.com)
[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of canonical transient receptor potential channel 1 (TRPC1) in the migration of human bronchial epithelial cells (16HBE) induced by transforming growth factor-β1 (TGF-β1). METHODS: Silencing ofTRPC1 gene expression was performed by siRNA. The cell activity and apoptosis were measured by CCK-8 assay and flow cytometry, respectively. The migration and invasion abilities of the 16HBE cells were detected by wound- healing assay and Transwell assay. The protein expression of E-cadherin and vimentin was determined by Western blot. RESULTS: TGF-β1 treatment significantly enhanced the cell migration distance compared with control groups (P<0.01). The results of CCK-8 assay and flow cytometry indicated that there were no significant difference in proliferation and apoptosis amongTRPC1 siRNA group, TGF-β1 group and control group (P>0.05). The results of wound-healing and Transwell assays showed that migration and invasion abilities inTRPC1 siRNA + TGF-β1 group were markedly suppressed compared with TGF-β1 group (P<0.01). The protein expression of E-cadherin and vimentin induced by TGF-β1 was inhibited byTRPC1 silencing compared with TGF-β1 group (P<0.05). CONCLUSION: TRPC1 is involved in the migration of human bronchial epithelial cells induced by TGF-β1 through regulating the protein expression of E-cadherin and vimentin.
[KEY WORDS]Transforming growth factor-β1; Human bronchial epithelial cells; Cell migration; Transient receptor potential channel 1
doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.013
[中圖分類號(hào)]R332; R562.25
[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A
通訊作者△Tel: 020-37103210; E-mail: xujide@163.com
*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81470205)
[收稿日期]2015- 07- 27[修回日期] 2015- 10- 19
[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)02- 0267- 06
#現(xiàn)工作單位:黃石市中心醫(yī)院