劉　芬，　李　勇，　趙　寧，　李東海，　江　榕，　曾振國(guó)，　邵　強(qiáng)，　彭菲菲，　王　燕，　錢(qián)克儉△

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2腫瘤科，3神經(jīng)外科，江西 南昌 330006)

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MicroRNA-132通過(guò)調(diào)控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)*

劉芬1，李勇2，趙寧1，李東海3，江榕1，曾振國(guó)1，邵強(qiáng)1，彭菲菲1，王燕1，錢(qián)克儉1△

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院1重癥醫(yī)學(xué)科，2腫瘤科，3神經(jīng)外科，江西 南昌 330006)

[摘要]目的： 探討microRNA-132(miR-132)通過(guò)調(diào)控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。方法: 向大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383中轉(zhuǎn)染miR-132 mimic、mimic陰性對(duì)照(NC)、miR-132 inhibitor或inhibitor NC，轉(zhuǎn)染后用脂多糖(LPS)和(或)乙酰膽堿(ACh)處理細(xì)胞；采用real-time PCR檢測(cè)乙酰膽堿酯酶(AChE)的mRNA表達(dá)；采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中AChE、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)和磷酸化STAT3(p-STAT3)，以及細(xì)胞漿和細(xì)胞核中核因子κB(NF-κB)蛋白的改變；采用AChE活性測(cè)試盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中AChE活性的改變；采用免疫熒光檢測(cè)NF-κB的核移位變化。結(jié)果: 上調(diào)或下調(diào)miR-132不影響AChE的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；上調(diào)miR-132可使AChE蛋白及活性的水平均顯著降低(P<0.05)，下調(diào)miR-132可使AChE蛋白及活性的水平均顯著升高(P<0.05)。當(dāng)給予LPS+ACh作用時(shí)，miR-132 mimic組對(duì)NF-κB p65核移位的抑制作用較mimic NC組更強(qiáng)(P<0.05)，miR-132 inhibitor組較inhibitor NC組更弱(P<0.05)；miR-132 mimic組對(duì)STAT3及p-STAT3蛋白的抑制作用較mimic NC組更強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論: miR-132通過(guò)調(diào)控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制可能是miR-132靶向作用AChE，抑制AChE對(duì)ACh的水解作用，從而增強(qiáng)ACh的抗炎作用，抑制NF-κB及STAT3的活化。

[關(guān)鍵詞]MicroRNA-132； 乙酰膽堿酯酶； 乙酰膽堿

MicroRNAs(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNAs，可以通過(guò)與靶基因mRNA特定位點(diǎn)結(jié)合而影響該mRNA的穩(wěn)定性或抑制蛋白的翻譯，參與轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控[1]。近年來(lái)研究顯示microRNAs在調(diào)控炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，其中microRNA-132(miR-132)參與調(diào)控病毒感染免疫反應(yīng)以及免疫刺激物如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)[2-3]。我們的前期研究[4]發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中，miR-132的表達(dá)隨著LPS刺激時(shí)間延長(zhǎng)而逐步升高；在體外培養(yǎng)環(huán)境，單獨(dú)給予LPS刺激時(shí)上調(diào)或下調(diào)miR-132不影響肺泡巨噬細(xì)胞炎癥因子的釋放，但當(dāng)加入膽堿能抗炎通路的重要遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)后， miR-132可增強(qiáng)ACh對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抗炎作用。因此我們推測(cè)miR-132通過(guò)調(diào)控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，但其中具體的分子作用機(jī)制尚不十分明確。本研究通過(guò)向肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-132 mimic及miR-132 inhibitor，觀察miR-132靶基因乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的表達(dá)及活性的改變，并在轉(zhuǎn)染肺泡巨噬細(xì)胞后給予LPS刺激或LPS+ACh作用，觀察ACh作用下游的2條主要信號(hào)通路即核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的改變，以探討miR-132通過(guò)調(diào)控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

材料和方法

1主要材料

大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；Ham’s F-12K培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma；胎牛血清購(gòu)自Gibco；miR-132 mimic、miR-132 inhibitor、mimic陰性對(duì)照(negative control，NC)和inhibitor NC購(gòu)自Invitrogen；PowerFectTMsiRNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自SignaGen；LPS和ACh購(gòu)自Sigma；PrimeScript? 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa；RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天；核抽提試劑盒購(gòu)自Active Motif；山羊抗AChE多克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗NF-κB p65多克隆抗體和山羊抗核纖層蛋白B(lamin B)多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；STAT3小鼠單克隆抗體和兔抗磷酸化STAT3(p-STAT3)多克隆抗體購(gòu)自CST；β-actin小鼠單克隆抗體購(gòu)自Anbo；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG、山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中衫金橋；Alexa Fluor? 488標(biāo)記驢抗兔IgG購(gòu)自Life Technologies；4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4’, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購(gòu)自Roche；AChE活性測(cè)試盒購(gòu)自南京建成。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383使用含15%胎牛血清的Ham’s F-12K培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2～3 d換液 1 次。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NR8383細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24 h接種至6孔板。向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-132 mi-mic、mimic NC、miR-132 inhibitor或inhibitor NC，轉(zhuǎn)染步驟按照PowerFectTMsiRNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.3實(shí)驗(yàn)分組將轉(zhuǎn)染了miR-132 mimic、mimic NC、miR-132 inhibitor或inhibitor NC的NR8383細(xì)胞用LPS和(或)ACh處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，給予LPS刺激的濃度為1 mg/L，ACh在LPS刺激前5 min加入，濃度為10 μmol/L。刺激12 h后收集各組細(xì)胞沉淀及細(xì)胞上清液，用于后續(xù)檢測(cè)。

2.4Real-time RCR轉(zhuǎn)染后24 h收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA，通過(guò)分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提總RNA的濃度及完整性。參照PrimeScript? 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用10 μL反應(yīng)體系，將RNA用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。將獲得的cDNA使用SYBR實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，采用20 μL反應(yīng)體系，AChE 的上游引物為5’-AAA CAT GCA GAA GAT GAG GAT-3’，下游引物為5’-GAC CAC TAT AGC AAG CAG GAA C-3’；β-actin的正向引物為5’-TAC TGC CCT GGC TCC TAG CA-3’，逆向引物為5’-TGG ACA GTG AGG CCA GGA TAG-3’。選取β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組AChE的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn)離心收集各組細(xì)胞，采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用于檢測(cè)AChE、STAT3、p-STAT3蛋白及內(nèi)參照β-actin蛋白；采用核抽提試劑盒提取細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，用于檢測(cè)NF-κB p65蛋白及內(nèi)參照β-actin、lamin B蛋白。通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度，10% SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離蛋白，后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育相應(yīng) I 抗過(guò)夜 [AChE(1∶200)，NF-κB p65(1∶500)，STAT3(1∶500)，p-STAT3(1∶500),β-actin(1∶3 000)，lamin B(1∶100)]。孵育相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗后，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯影，曝光，分析各條帶灰度值。

2.6AChE活性的檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24 h收集各組細(xì)胞上清液，參照AChE活性測(cè)試盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中AChE的活性變化，于酶標(biāo)儀412 nm處測(cè)定吸光度。

2.7免疫熒光觀察將肺泡巨噬細(xì)胞接種至細(xì)胞爬片，根據(jù)分組給予相應(yīng)處理。4%多聚甲醛固定20 min后PBS漂洗，0.2% Triton X-100透膜處理5 min，PBS漂洗后置入含5%牛血清蛋白的PBS中封閉1 h，NF-κB p65的 I 抗(1∶50)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗后Alexa Flour 488標(biāo)記的 II 抗室溫避光孵育1 h，PBS漂洗，加入細(xì)胞核染色液DAPI染核2 min，PBS漂洗后滴加防熒光淬滅劑封片，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，采用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析，高倍鏡視野(×400)計(jì)數(shù)總細(xì)胞和NF-κB p65核染色陽(yáng)性細(xì)胞。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1調(diào)控miR-132對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞AChE表達(dá)及活性的影響

在肺泡巨噬細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-132 mimic及miR-132 inhibitor 24 h后，檢測(cè)細(xì)胞中AChE mRNA、蛋白水平及細(xì)胞上清液中AChE活性的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)miR-132不影響AChE的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；而miR-132 mimic組與mimic NC組相比，AChE蛋白及活性水平均顯著降低(P<0.05)；反之,miR-132 inhibitor組與inhibitor NC組相比，AChE蛋白及活性水平均顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of miR-132 on the expression and activity of AChE in alveolar macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic NC group;#P<0.05vsinhibitor NC group.

圖1調(diào)控miR-132對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞AChE表達(dá)及活性的影響

2調(diào)控miR-132聯(lián)合ACh對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB核移位的影響

在肺泡巨噬細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-132 mimic及miR-132 inhibitor 24 h后，給予LPS(1 mg/L)刺激或LPS+ACh(10 μmol/L)作用12 h，通過(guò)免疫熒光和Western blot檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞中NF-κB p65的核移位情況及細(xì)胞核內(nèi)外NF-κB p65蛋白的改變，結(jié)果顯示在肺泡巨噬細(xì)胞未給予LPS刺激時(shí)，NF-κB p65主要分布在細(xì)胞胞漿中；當(dāng)給予LPS刺激時(shí)，miR-132 mimic組和mimic NC組的NF-κB p65均從胞漿向細(xì)胞核移位，但兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而當(dāng)給予LPS+ACh作用時(shí)，miR-132 mimic組和mimic NC組的NF-κB p65的核移位均受抑制，但miR-132 mimic組對(duì)NF-κB p65核移位的抑制作用較mimic NC組更強(qiáng)(P<0.05)。miR-132 inhibitor組與inhibitor NC組相比，NF-κB p65核移位的情況在給予LPS刺激時(shí)兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但在給予LPS+ACh作用時(shí)，miR-132 inhibitor組對(duì)NF-κB p65核移位的抑制作用較inhibitor NC組更弱(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The regulatory effect of miR-132 combined with ACh on NF-κB nuclear translocation in the alveolar macrophages. A: immunofluorescence detection of NF-κB p65 (green) nuclear translocation (×400). The cell nuclei were stained by DAPI (blue). NF-κB nuclear translocation was expressed as the percentage of nuclear NF-κB p65 positive relative to total cells. B， C: detection of nuclear and cytoplasmic NF-κB p65 levels by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic NC group;#P<0.05vsinhibitor NC group.

圖2調(diào)控miR-132聯(lián)合ACh對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB核移位的影響

3調(diào)控miR-132聯(lián)合ACh對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞STAT3活化的影響

在肺泡巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-132 mimic 24 h后，給予LPS(1 mg/L)刺激或LPS+ACh(10 μmol/L)作用12 h，檢測(cè)細(xì)胞中STAT3蛋白及其磷酸化水平的變化，結(jié)果顯示在給予LPS刺激后，肺泡巨噬細(xì)胞中STAT3蛋白及p-STAT3的蛋白含量均增加，但miR-132 mimic組和mimic NC組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；ACh的加入可抑制LPS誘導(dǎo)的STAT3及p-STAT3蛋白的增加，其中miR-132 mimic組對(duì)STAT3及p-STAT3蛋白的抑制作用較mimic NC組更強(qiáng)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The regulatory effect of miR-132 combined with ACh on STAT3 activation in the alveolar macrophages. Mean±SD.n=3. NC: negative control.*P<0.05vsmimic NC group.

圖3調(diào)控miR-132聯(lián)合ACh對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞STAT3活化的影響

討論

膿毒癥時(shí)細(xì)菌毒素如LPS釋放入血引發(fā)肺部炎癥級(jí)聯(lián)放大，導(dǎo)致膿毒癥肺損傷，肺泡巨噬細(xì)胞作為主要的肺內(nèi)炎癥始動(dòng)細(xì)胞在膿毒癥肺損傷中起著重要的作用[5]。文獻(xiàn)報(bào)道及我們的前期研究表明microRNAs參與調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[6-7]，miR-132是其中之一，但其調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制尚不十分清楚。MicroRNA主要的作用機(jī)制是通過(guò)與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)域(untranslated region，UTR)的特異序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。 Shaked等[8]通過(guò)研究證實(shí)miR-132可靶向作用AChE mRNA的3’UTR，增強(qiáng)大腦通過(guò)膽堿能通路調(diào)控全身炎癥反應(yīng)的能力，另有研究表明miR-132通過(guò)靶向作用AChE參與改善人類(lèi)炎癥性腸病的炎癥反應(yīng)[9]，以及參與介導(dǎo)壓力應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知障礙[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)在肺泡巨噬細(xì)胞中調(diào)控miR-132不影響AChE mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，但上調(diào)miR-132可降低AChE蛋白及活性的水平，下調(diào)miR-132可增加AChE蛋白及活性水平，提示miR-132在肺泡巨噬細(xì)胞中可靶向作用AChE，從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控AChE的表達(dá)。

AChE是一種特異性催化水解神經(jīng)遞質(zhì)ACh的酶，近年研究發(fā)現(xiàn)迷走神經(jīng)釋放的ACh可與巨噬細(xì)胞上的α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)相互作用，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)NF-κB及Janus激酶2(Janus kinase 2, JAK2)/STAT3信號(hào)通路，減少腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等促炎因子的釋放，形成一條膽堿能抗炎通路調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)[11-12]。鑒于ACh由迷走神經(jīng)分泌，在體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中缺乏，因此我們?cè)诜闻菥奘杉?xì)胞中加入外源性ACh，以便研究miR-132調(diào)控膽堿能通路的機(jī)制。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肺泡巨噬細(xì)胞中上調(diào)miR-132并加入ACh后，可抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65的核移位，以及抑制STAT3及p-STAT3蛋白的增加，并且其抑制作用強(qiáng)于ACh的作用。目前的研究認(rèn)為NF-κB及JAK2/STAT3這2條信號(hào)通路是ACh最主要的抗炎機(jī)制，其中NF-κB通路的激活對(duì)TNF-α等促炎因子的產(chǎn)生具有重要的作用，研究表明[13]膽堿受體激動(dòng)劑尼古丁可通過(guò)激活α7nAChR后抑制NF-κB的活化，從而抑制巨噬細(xì)胞促炎因子的分泌，與本研究結(jié)果相符。而對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路目前的研究存在爭(zhēng)議，有報(bào)道[14]認(rèn)為L(zhǎng)PS刺激RAW264.7細(xì)胞后通過(guò)激活STAT3的磷酸化而誘導(dǎo)白細(xì)胞介素 1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)的生成，而加入尼古丁后通過(guò)抑制STAT3蛋白及p-STAT3的水平，從而抑制炎癥因子的產(chǎn)生，與我們的研究結(jié)果一致。另外也有研究[15]發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的腹腔巨噬細(xì)胞中尼古丁呈劑量依賴(lài)的方式增加STAT3的磷酸化及細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)的表達(dá)，與我們的結(jié)果相反，原因可能與多種炎癥因子之間相互作用激活有關(guān)。

綜上所述，miR-132調(diào)控膽堿能通路減輕肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，與miR-132通過(guò)靶向作用AChE，抑制AChE對(duì)ACh的水解作用，從而增強(qiáng)ACh的抗炎作用，抑制NF-κB及STAT3的活化有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

MicroRNA-132 inhibits inflammation of alveolar macrophages by regulating cholinergic anti-inflammatory pathwayLIU Fen1, LI Yong2, ZHAO Ning1, LI Dong-hai3, JIANG Rong1, ZENG Zhen-guo1, SHAO Qiang1, PENG Fei-fei1, WANG Yan1, QIAN Ke-jian1

(1DepartmentofCriticalCareMedicine,2DepartmentofOncology，3DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:qiankejianicu@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of microRNA-132 (miR-132) on alveolar macrophage inflammation. METHODS: Rat alveolar macrophage cell line NR8383 was transfected with miR-132 mimic, mimic negative control (NC), miR-132 inhibitor, or inhibitor NC. The cells were divided into transfection group, transfection + lipopolysaccharide (LPS) group, and transfection + LPS + acetylcholine (ACh) group. The mRNA expression of acetylcholinesterase (AChE) was detected by real-time PCR. The protein levels of AChE, signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and phosphorylated STAT3 (p-STAT3) in the cells, and nuclear factor-κB (NF-κB) in the cytoplasm and nucleus were analyzed by Western blot. The activity of AChE in the culture supernatant was measured by AChE activity assay kit. The nuclear translocation of NF-κB was detected by immunofluorescence assay. RESULTS: Up-regulation or down-regulation of miR-132 had no effect on the mRNA expression of AChE. However, up-regulation of miR-132 decreased the protein level of AChE compared with mimic NC group (P<0.05). Transfection with miR-132 inhibitor increased the protein expression of AChE compared with inhibitor NC group (P<0.05). In the alveolar macrophages treated with LPS+ACh, the inhibition of nuclear translocation of NF-κB p65 in miR-132 mimic group was more effective than that in mimic NC group (P<0.05). The inhibitory effect in miR-132 inhibitor group was weaker than that in inhibitor NC group (P<0.05). The inhibitory effect of miR-132 mimic on the protein levels of STAT3 and p-STAT3 was stronger than that of mimic NC (P<0.05). CONCLUSION: miR-132 in LPS-stimulated alveolar macrophages reinforced ACh-mediated anti-inflammatory reaction by targeting AChE to suppress ACh hydrolyzation, which was related to the suppression of NF-κB and STAT3 activation.

[KEY WORDS]MicroRNA-132; Acetylcholinesterase; Acetylcholine

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.012

[中圖分類(lèi)號(hào)]R392.12

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 0791-88692533; E-mail: qiankejianicu@163.com

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81101410；No.81460292)；江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20122BAB205002)

[收稿日期]2015- 08- 10[修回日期] 2015- 12- 04

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)02- 0261- 06