劉善淘,　朱錦燦,　陳小宇,　劉革修

(暨南大學血液病研究所，廣東 廣州 510632)

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紅景天苷對內皮祖細胞的輻射防護作用*

劉善淘,朱錦燦,陳小宇,劉革修△

(暨南大學血液病研究所，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 探討紅景天苷對內皮祖細胞(EPCs)的輻射防護作用，并分析其機制。方法: 體外培養(yǎng)正常人外周血EPCs，觀察紅景天苷對輻射后EPCs活性、黏附、遷移及凋亡的影響。應用CCK-8法檢測細胞活性，流式細胞術檢測細胞凋亡率, Western blotting法檢測細胞內磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路中Akt蛋白表達水平。結果: 4 Gy [60Co]γ射線輻射可導致EPCs損傷，不僅細胞活性、黏附和遷移能力下降，而且細胞凋亡增加；與輻射對照組比較, 紅景天苷則能部分逆轉輻射對EPCs的損傷，提高EPCs的活性、黏附和遷移能力，減少輻射導致的細胞凋亡，增加細胞內磷酸化Akt蛋白的水平。但這些作用可被PI3K特異性抑制劑LY294002削弱。結論: 紅景天苷對內皮祖細胞輻射損傷具有一定的防護作用，其機制可能與增強PI3K/Akt通路的作用有關。

[關鍵詞]紅景天苷； 輻射； 內皮祖細胞

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是血管內皮細胞的前體細胞，是血管內皮更新與修復以及損傷組織新生血管形成的重要細胞。研究顯示，EPCs在心血管疾病、腦缺血損傷、肺損傷以及造血干細胞移植等治療中具有重要作用[1-7]。然而，影像檢查及治療、腫瘤放射治療等不可避免損傷正常的EPCs，從而產生一定的副作用并最終影響患者身體健康狀態(tài)。探索高效低毒或無毒的輻射防護劑，使其既不影響輻射對臨床的運用作用，同時又能降低輻射對人體正常組織的放射損傷，一直是國內外抗輻射藥物研究經久不衰的熱點。最近，研究顯示，藏藥紅景天在心腦血管疾病治療方面顯示顯著效果[8-9]，其重要提取物紅景天苷(salidroside，Sal)具有擴張阻力血管和容量血管、降低周圍阻力，使動脈血壓和左室舒張末壓下降。說明其對血管平滑肌細胞或者內皮細胞具有重要作用。本文通過研究紅景天苷對內皮祖細胞的輻射防護作用并初步了解其信號途徑機制，為紅景天的應用提供基礎。

材料和方法

1材料

內皮細胞基礎培養(yǎng)基2(endothelial basal me-dium-2，EBM-2)和內皮細胞生長培養(yǎng)基2(endothelial growth medium-2，EGM-2)購自Clonetics；人纖維連接蛋白(human fibronectin, HFN)購自Chemicon；FITC-UEA-I 為Sigma 產品; DiI-acLDL購自Molecular Probe; 小鼠抗人絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase, Akt)單克隆抗體和小鼠抗人磷酸化Akt單克隆抗體(Millipore);小鼠抗人GAPDH 為Chemicon International產品；Transwell小室購自Corning；紅景天苷購自中國食品藥品檢定所，用培養(yǎng)基配制成40 mmol/L的儲存液；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl-inositol 3-kinase，PI3K)抑制劑LY294002 (Sigma)用DMSO配制成1 mmol/L的儲存液，-20 ℃保存。

2方法

2.1EPCs培養(yǎng)與鑒定培養(yǎng)、鑒定方法參見文獻進行[10]。3名在校健康志愿男生，年齡22～24歲，肘靜脈取血，肝素抗凝，密度梯度離心法分離單個核細胞，PBS洗滌2次后接種于含20%胎牛血清的EBM-2和EGM-2混合培養(yǎng)基、HFN(5 μg/cm2)包被的培養(yǎng)瓶，5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)。4 d后用PBS 洗去非貼壁細胞, 換培養(yǎng)液，6 d后再用PBS洗掉非貼壁細胞, 貼壁細胞供實驗用。待鑒定的細胞去培養(yǎng)基，PBS洗2遍、加稀釋的DiI-acLDL(用培養(yǎng)基按1∶100稀釋)、37 ℃下孵育2 h、PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定10 min、PBS洗2遍后，1%曲拉通孵育20 min、PBS洗2遍，加1∶100稀釋的lectin孵育1 h、PBS洗2遍、DAPI染色、熒光顯微鏡下鑒定UEA-I和acLDL 雙染色陽性的EPCs，隨機選擇10個視野(×200)計數EPCs。實驗分組：正常對照組(normal control, NC)、照射組(irradiation control, IC)、Sal實驗組(照射前1 h 加入Sal)以及LY294002組(Sal+LY294002)。IC組、Sal實驗組和LY294002組均接受γ射線照射，劑量為 4.0 Gy，劑量率為0.35 Gy/min，在暨南大學第一附屬醫(yī)院輻照中心進行。Sal濃度(80.0 μmol/L)和LY294002濃度(20 μmol/L)均依據文獻及預實驗選定。每份血液來源的EPCs完成1次獨立實驗。

2.2CCK-8 法檢測細胞活性將EPCs細胞處理為單細胞懸液，調整細胞密度為6×107/L，每孔 100 μL 細胞懸液接種于 96 孔板。一塊板接種對照組細胞，另一塊板接種照射組、Sal實驗組和LY294002組細胞。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，實驗組換成含Sal的培養(yǎng)基，LY294002組換成含Sal和LY294002的培養(yǎng)基，對照組及空白組換成新的普通培養(yǎng)基。1 h后輻射組、實驗組和LY294002組經[60Co]γ射線照射，總劑量4.0 Gy。37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48及72 h后，棄上清液后向每孔加入 10μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)箱內孵育 2 h，當顏色開始變深時用酶標儀測定 450 nm(參比波長為630 nm)處的吸光度(A)值。實驗設3個復孔，重復3 次。

2.3EPCs黏附能力檢測輻射后的EPCs經0.25%胰蛋白酶消化、收集、懸浮在500 μL培養(yǎng)液中并計數。將輻射處理的EPCs接種在HFN包被的96孔培養(yǎng)板，每孔接種1×104個細胞，在37 ℃下培養(yǎng)30 min，計數貼壁細胞。

2.4EPCs遷移能力檢測用0.25%胰酶消化EPCs, 收集并計數。將含Sal的500 μL培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室, 輻射處理含2×103EPCs 100 μL注入上室,培養(yǎng)24 h, 刮去濾膜上未遷移細胞,甲醇固定、Giemsa染色, 隨機選擇3個顯微鏡視野(×400), 計數遷移的細胞。

2.5流式細胞術檢測EPCs凋亡率取EPCs單細胞懸液，以 1×108/L的細胞密度分別接種于 6 孔板中，照射組、Sal實驗組和LY294002組照射后24 h 和 48 h 收集細胞，1 000 r/min離心 5 min，PBS洗滌細胞2次，再次1 000 r/min離心 5 min，收集細胞，經Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)雙染色后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.6Westertn blotting檢測細胞Akt蛋白的表達處理24 h后收集細胞提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。取30 μg蛋白上樣，進行8%～12%的SDS-PAGE及轉膜，然后用含5%脫脂奶粉的TBST對膜封閉30 min，加入稀釋的Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的相應Ⅱ抗IgG(1∶3 000)于室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次?；瘜W熒光法檢測，采集圖像，采用Gelpro 4.0軟件對目的蛋白進行定量分析。以GAPDH作為內參照。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；計數資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1Sal對輻射EPCs細胞活性的影響

輻射組EPCs活性較對照組低，Sal組EPCs活性較輻射組增加，在24 h時即有明顯差異， 72 h時較對照組增加了1.83倍(P<0.05)。且Sal組EPCs活性較對照組有相對增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。而LY294002組EPCs活性較Sal組降低。這說明輻射顯著抑制EPCs活性，Sal(80 μmol/L)則能保護輻射對EPCs活性減弱的作用，LY294002(20 μmol/L)則能抑制紅景天苷對輻射后EPCs活性增加的作用,見表1。

表1紅景天苷對輻射后內皮祖細胞的細胞活性的影響

Table 1.The effects of salidroside (Sal) on the viability of irradiated EPCs (A450.Mean±SD.n=3)

Group24h18h72hNC0.127±0.0260.181±0.0290.353±0.029IC0.115±0.0260.124±0.026*0.164±0.028*Sal0.125±0.026△0.228±0.029△0.366±0.029△LY294002+Sal0.108±0.026#0.107±0.026#0.106±0.026#

*P<0.05vsNC;△P<0.05vsIC;#P<0.05vsSal.

2Sal對輻射EPCs遷移的影響

Transwell小室培養(yǎng)檢測細胞遷移，在400倍顯微鏡下計數遷移的細胞數，結果顯示，輻射顯著抑制EPCs遷移，輻射組遷移的細胞數是對照組的31%；Sal明顯改善輻射處理的EPCs 的遷移能力，Sal組遷移的細胞數是輻射組的1.8倍；LY294002則能抑制Sal的作用，見圖1。

Figure 1.Effects of salidroside (Sal) on migration of irradiated EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC;△△P<0.01vsIC;##P<0.01vsSal.

圖1紅景天苷對輻射后EPCs遷移能力的影響

3Sal對輻射EPCs黏附能力的影響

輻射顯著抑制EPCs黏附能力，輻射組貼壁細胞數是對照組的30%；Sal明顯改善輻射處理的EPCs 黏附能力，Sal組貼壁細胞數是輻射組2.1倍；LY294002則能抑制Sal的作用，見圖2。

Figure 2.Effects of salidroside (Sal) on adhesion of irradiated EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC;△△P<0.01vsIC;##P<0.01vsSal.

圖2紅景天苷對輻射后EPCs黏附能力的影響

4Sal對輻射EPCs凋亡的影響

結果顯示，輻射誘導EPCs凋亡，輻射組EPCs 凋亡率是對照組的5.2倍；Sal明顯抑制輻射誘導的EPCs 凋亡，LY294002則能抑制Sal的作用，見圖3。

5Sal對輻射EPCs內p-Akt蛋白水平的影響

結果顯示，紅景天苷顯著增加p-Akt蛋白水平；LY294002則能抑制紅景天苷的作用，使p-Akt蛋白水平降低，見圖4。

討論

當今世界人類生活和工作中常常需要使用各種輻射，尤其在醫(yī)學診斷與治療中輻射已經成為重要工具。如臨床上很多疾病在診斷或治療上常常需要運用到輻射技術，如心血管疾病行冠脈造影術明確冠心病的診斷及在Χ線照射下行支架置入術及腫瘤行放射治療等。同樣，在腦缺血損傷、肺損傷以及造血干細胞移植等在醫(yī)學診治過程中應用輻射技術也很常見。但是輻射也對人身體造成嚴重損傷，影響組織細胞功能。輻射防護在生活與醫(yī)學中仍然具有重要意義。內皮祖細胞是血管內皮更新與修復以及損傷組織新生血管形成的重要細胞，主要來源于骨髓。輻射技術是診治疾病的重要手段，也是引起正常組織放射損傷的主要原因。所以，預防輻射損傷EPCs則可能對這些疾病預后具有重要影響。

Figure 3.Effects of salidroside (Sal) on apoptosis of irradiated EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC;△△P<0.01vs IC;##P<0.01vsSal.

圖3紅景天苷對輻射后EPCs凋亡作用的影響

Figure 4.Effects of salidroside (Sal) on the expression of p-Akt protein in irradiated EPCs. Mean±SD.n=3.△P<0.05vsIC;#P<0.05vsSal.

圖4紅景天苷對輻射后EPCs細胞內p-Akt蛋白表達的影響

Sal來源于紅景天屬植物的塊根，是藏藥紅景天的主要成分，不僅具有抗疲勞、抗氧化、神經保護、心血管保護等功能[1-3,11-12]，而且在輻射預防方面也有相關研究報道。1997年鄧偉國等[13]研究顯示紅景天苷有防護X線對脂質和細胞膜損傷的作用。朱錦燦等[14]研究顯示紅景天苷能促進輻射損傷的小鼠造血恢復。最近，Tang等[15]研究顯示，紅景天苷具有促進內皮祖細胞分化形成血管作用和對氧化應激損傷的保護作用。我們的研究結果顯示，紅景天苷能部分逆轉輻射對EPCs的損傷，提高輻射損傷EPCs的活性、黏附和遷移能力，減少輻射導致的細胞凋亡，且其輻射防護作用與增強EPCs的PI3K/Akt通路作用有關。紅景天苷對內皮祖細胞的輻射防護作用是本研究新發(fā)現，其增強EPCs的PI3K/Akt通路作用機制與已有的紅景天苷作用機制有一定相關性[10,15]。這提示紅景天苷在醫(yī)學診斷與治療中的輻射防護作用，為其輻射防護應用提供基礎。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Protective effects of salidroside on endothelial progenitor cells damaged by radiationLIU Shan-tao, ZHU Jin-can, CHEN Xiao-yu, LIU Ge-xiu

(InstituteofHematology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliugx@jnu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To explore the protective effects of salidroside on endothelial progenitor cells (EPCs) damaged by radiation and its mechanisms.METHODS: EPCs from normal peripheral blood were cultured in fibronectin-coated flasks with endothelial progenitor medium. The effects of salidroside on the viability, migration, adhesion and apoptosis of radiation-damaged EPCs were detected. The viability, apoptosis and migration of the cells were assayed by CCK-8 assay, flow cytometry and Transwell chamber experiment, respectively. The cell adhesion assay was performed by re-plating the cells on fibronectin-coated dishes, and then the adherent cells were counted. The expression of Akt protein in the cells was assessed by Western blotting. RESULTS: Salidroside improved the viability, and migratory and adhesive capacities of the EPCs, and decreased the apoptosis after radiation. Salidroside also increased the protein level of phosphorylated Akt. However, the effects of salidroside on radiation-damaged EPCs were inhibited by phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002. CONCLUSION: Salidroside protects EPCs from radiation damages and its mechanism is associated with enhancing phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway.

[KEY WORDS]Salidroside; Radiation; Endothelial progenitor cells

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.008

[中圖分類號]R979.6; R363

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 020-85220262； E-mail: tliugx@jnu.edu.cn

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.81270568)

[收稿日期]2015- 07- 24[修回日期] 2015- 10- 12

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0240- 05