孫　健，　白淑芝，　李　爽，　許曉義，　袁　輝，　魏　韜，　徐長慶，　欒海蓉△

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

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CaSR在淫羊藿苷誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化中的作用*

孫健1，白淑芝2，李爽1，許曉義1，袁輝1，魏韜1，徐長慶2，欒海蓉1△

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

[摘要]目的： 觀察鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)對(duì)淫羊藿苷(ICA)誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響。方法: 129小鼠ES-D3細(xì)胞經(jīng)直接懸浮法形成擬胚體(EBs)，應(yīng)用ICA定向誘導(dǎo)，透射電鏡觀察分化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu);免疫熒光和Western blot分別檢測細(xì)胞有無α-輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)和肌鈣蛋白I(cTnI)的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞分化率；Western blot檢測心肌特異轉(zhuǎn)錄因子NKx2.5、GATA-4和CaSR的蛋白表達(dá)。結(jié)果: ICA誘導(dǎo)2 d后，可見自發(fā)性收縮的細(xì)胞簇;隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長，α-actinin和cTnI蛋白的表達(dá)逐漸增多；CaSR、NKx2.5和GATA-4蛋白在分化早期表達(dá)最多，持續(xù)表達(dá)至晚期；電鏡觀察分化細(xì)胞中可見連接結(jié)構(gòu)、肌絲;CaSR激動(dòng)劑新霉素能夠增加早期EBs中CaSR、NKx2.5和GATA-4的表達(dá)，CaSR抑制劑NPS2390能夠阻斷上述作用。結(jié)論: CaSR在胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞中有表達(dá)，CaSR活化可通過增加NKx2.5和GATA-4的表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化。

[關(guān)鍵詞]鈣敏感受體； 淫羊藿苷; 細(xì)胞分化； 心肌細(xì)胞

由于成熟的心肌細(xì)胞缺乏再生能力，一旦損傷只能由瘢痕替代，嚴(yán)重影響心臟的功能甚至導(dǎo)致心力衰竭。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)具有增殖和分化的全能性[1]，是一種很有實(shí)用價(jià)值的、理想的心肌細(xì)胞移植療法的有效來源。揭示促進(jìn)ESCs向心肌細(xì)胞定向分化并提高轉(zhuǎn)化率是亟待解決的問題。

本課題組前期研究表明，鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)在小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)有表達(dá)，其活化可以增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度[2]。但其對(duì)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化的影響及機(jī)制，迄今尚不清楚。淫羊藿苷(icariin，ICA)是一個(gè)新型的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和分化劑，有研究報(bào)道在體外淫羊藿苷可誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[3-4]。因此，本文以mESCs為觀察對(duì)象，通過淫羊藿苷誘導(dǎo)，對(duì)上述尚未解決的問題開展研究。

材料和方法

1材料

小鼠胚胎干細(xì)胞株129小鼠ES-D3細(xì)胞株CRL-11632購于ATCC；胎牛血清購自Gibco；小鼠白血病抑制因子購自Chemicon；CaSR、 FITC熒光標(biāo)記 II 抗購自Sigma；Fluo-3/Am購自Invitrogen；心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)和α-輔肌動(dòng)蛋白(α-actinin)抗體購自Santa Cruz。

2方法

2.1ES-D3的培養(yǎng)及向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化小鼠ES-D3復(fù)蘇，第2天換液。2 d后，加入0.25%胰酶-EDTA消化傳代，傳代后選擇生長狀態(tài)較好的ESCs克隆充分消化離心后用分化培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，計(jì)數(shù)后接種于10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿接種10 mL細(xì)胞懸液，放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，制備擬胚體(embryoid bodies，EBs)。胚體懸浮培養(yǎng)5 d后，按每孔10個(gè)胚體數(shù)量接種于6孔板進(jìn)行胚體貼壁培養(yǎng)及誘導(dǎo)，每板分別設(shè)ICA組及實(shí)驗(yàn)組各3孔，培養(yǎng)并每天觀察。

2.2免疫熒光分析預(yù)冷0.1 mol/L PBS沖洗各組細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，1%山羊血清封閉30 min；分別用抗CaSR、cTnI和α-actinin抗體(1∶50)孵育，4 ℃過夜，陰性對(duì)照用0.1 mol/L PBS代替 I 抗；0.1 mol/L PBS沖洗3次；FITC標(biāo)記的IgG(1∶50)37 ℃孵育1 h；PBS沖洗3次，核用DAPI復(fù)染。熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.3Western blot法檢測鈣敏感受體和心肌特異轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA-4的表達(dá)將待提取蛋白的細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，置于冰上，預(yù)冷PBS清洗3次；吸去PBS，加入適量RIPA裂解液，冰上孵育30 min，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，電壓100 V；電流300 mA，冰浴中轉(zhuǎn)膜90 min。加入 I 抗，室溫振蕩孵育1 h，4 ℃過夜。洗膜后TBST稀釋各相應(yīng) II 抗，室溫振蕩孵育1 h；堿性磷酸酶法顯色，凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

2.4電鏡技術(shù)取貼壁培養(yǎng)早期(貼壁后5 d)、中期(貼壁后10 d)、晚期(貼壁后17 d)的細(xì)胞，預(yù)冷PBS懸浮后2 000 r/min離心10 min，使細(xì)胞形成團(tuán)塊。2.5% 戊二醛4 ℃固定細(xì)胞2 h，常規(guī)脫水、透明、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射電鏡下觀察各細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，拍照。

2.5流式細(xì)胞術(shù)mESCs誘導(dǎo)分化的第12天，1%多聚甲醛固定后，預(yù)冷的0.1 mol/L PBS沖洗EBs 3次，使之分離成單細(xì)胞的懸浮液。cTnI(1∶100)孵育4 ℃過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗兔IgG 37 ℃ 1 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測cTnI表達(dá)陽性的心肌細(xì)胞所占的百分比。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件, 采用單因素方差分析比較均數(shù)間差異，多重比較應(yīng)用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1mESCs的誘導(dǎo)分化

生長在瓊脂上未分化的單個(gè)mESCs較小，呈圓形。懸浮培養(yǎng) 2 d后，mESCs聚集成EBs，呈立體球形結(jié)構(gòu)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，EBs進(jìn)一步成熟，體積增大，邊界較光滑，中間細(xì)胞密度相對(duì)較大，顏色較深。5 d后將EBs轉(zhuǎn)移到明膠鋪被的培養(yǎng)皿貼壁生長。2～3 d可見自發(fā)性節(jié)律性收縮的細(xì)胞群，跳動(dòng)頻率約20～60 beats/min，分化中期可達(dá)70～100 beats/min，1個(gè)EBs可包含1個(gè)或者多個(gè)收縮中心，表明心肌細(xì)胞已經(jīng)分化；高倍鏡下可觀察到纖維狀的細(xì)胞群，見圖1。

2ICA誘導(dǎo)mESCs分化的心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡下可看到分化細(xì)胞胞漿內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，合成功能增強(qiáng)，含有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器外，可以看到大量成束的肌絲，細(xì)胞間的橋粒和緊密聯(lián)接等連接結(jié)構(gòu)，見圖2。

Figure 1.The differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) into cardiomyocytes. A: undifferentiated mESCs in agar (×200); B: 2 days EBs in suspension method (×100); C: 4 d EBs in suspension method (×100); D: beating cells of cardiac clusters derived from EBs with ICA induction (×200, rectangular frames refereed to the contracting areas).

圖1小鼠ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

Figure 2.The ultrastructural alteration of differentiation cells under transmission electronic microscope. A: the bundles of myofilaments were observed in the cytoplasm; B: the arrow indicates the closely connected (rectangular frame refereed to desmosome).

圖2透射電鏡下分化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化

3心肌特異性蛋白α-actinin和cTnI在ICA誘導(dǎo)的mESCs分化的心肌細(xì)胞的表達(dá)

免疫熒光原位檢測心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白α-actinin和cTnI的表達(dá)，結(jié)果顯示EBs內(nèi)表達(dá)大量α-actinin或cTnI，F(xiàn)ITC可被激發(fā)出綠色熒光，DAPI可將細(xì)胞核染成藍(lán)色，當(dāng)用PBS代替 I 抗時(shí)，沒有陽性染色，見圖3。

Figure 3.The expression of cardiac-specific proteins in mESC-derived cardiomyocytes (mESC-CMs) was detected by immunofluorescence (×200).

圖3通過免疫熒光檢測心肌特異性蛋白在mESC-CMs的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示在貼壁培養(yǎng)的第1天(d1)α-actinin表達(dá)量較低，而cTnI幾乎不表達(dá)。隨著分化時(shí)間的推移，α-actinin和cTnI表達(dá)逐漸升高，其中在分化第9天(d9)顯著增強(qiáng)，在分化第13天(d13)達(dá)到較高水平，之后變化不大，見圖4。

4心肌CaSR蛋白和特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、Nkx2.5的表達(dá)

EBs進(jìn)行貼壁培養(yǎng)后第 1 d(即分化d1)，心肌CaSR蛋白和特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4均有表達(dá)，繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，三者的表達(dá)均相應(yīng)增加。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)在mESCs分化為心肌細(xì)胞過程中，CaSR、Nkx2.5和GATA-4表達(dá)具有一定的規(guī)律性，都是在d5達(dá)到高峰，之后略有下降，見圖5。

5CaSR活化對(duì)mESCs向心肌細(xì)胞分化的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在ICA組、0.4 mmol/L新霉素和0.01 mmol/L NPS2390組，cTnI陽性細(xì)胞分別占總數(shù)的(14.97±0.80)%、(25.82±2.41)%和(10.26±0.16)%，經(jīng)過Bonferroni法進(jìn)行校正檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖6。

Figure 4.The expression of α-actinin and cTnI in the differentiated cells by Western blot. Mean±SD.n=3.★P<0.05vsd1 group.

圖4Western blot檢測誘導(dǎo)分化細(xì)胞的α-actinin和cTnI蛋白表達(dá)

Figure 5.The expression of Nkx2.5, GATA-4 and CaSR in differentiated cells by Western blot.Mean±SD.n=3.★P<0.05vsd1 group.

圖5Western blot檢測誘導(dǎo)分化細(xì)胞Nkx2.5、GATA-4 和CaSR蛋白的表達(dá)

6CaSR活化對(duì)Nkx2.5和GATA4蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明，用CaSR的激動(dòng)劑0.4 mmol/L新霉素處理24 h后，GATA-4 和Nkx2.5蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組增多(P<0.05)；而抑制劑NPS2390對(duì)其具有抑制作用，阻斷了激動(dòng)劑的作用，見圖7。

討論

心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不可再生，細(xì)胞移植可以用來修復(fù)損傷或死亡的心肌細(xì)胞，以改善心臟功能，是一種潛在的很有實(shí)用價(jià)值的治療措施[5]。ESCs是具有多向分化潛能的全能干細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中能分化成包括自發(fā)性搏動(dòng)心肌細(xì)胞在內(nèi)的3個(gè)胚層的所有體細(xì)胞[6]。提高ESCs向心肌細(xì)胞的定向分化率并揭示其機(jī)制，日益受到心血管領(lǐng)域科學(xué)工作者的關(guān)注。

體外誘導(dǎo)mESCs定向分化為心肌細(xì)胞主要是通過形成EBs的方法，本實(shí)驗(yàn)采用直接懸浮法，同時(shí)選擇傳統(tǒng)中藥ICA做誘導(dǎo)劑，可以形成大量的EBs為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供便利。有研究發(fā)現(xiàn)在ESCs向心肌細(xì)胞分化的過程中，心肌細(xì)胞特異性肌小節(jié)蛋白依次表達(dá)，其中出現(xiàn)較早的是輔肌動(dòng)蛋白，出現(xiàn)較晚的是肌鈣蛋白。其中心肌肌鈣蛋白Ⅰ是心室和心房細(xì)胞中典型的蛋白，在較晚期才有少量表達(dá)，這與早期胚胎內(nèi)心肌發(fā)育過程一致。本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光法檢測α-actinin和cTnI的表達(dá)情況，結(jié)果顯示mESCs誘導(dǎo)分化的細(xì)胞中α-actinin和cTnI呈陽性表達(dá)；Western blot檢測結(jié)果顯示，在整個(gè)心肌誘導(dǎo)分化過程中，α-actinin表達(dá)量都保持在較高水平，并且晚期明顯高于早期；而cTnI在分化的早期表達(dá)較少，在分化中晚期逐漸升高。這與前人的研究成果相似[4, 7]。說明在誘導(dǎo)分化過程中，隨分化進(jìn)程的進(jìn)展心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白的合成逐漸增多，符合胚胎心臟發(fā)育的規(guī)律。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)電鏡超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示隨著誘導(dǎo)分化進(jìn)程的發(fā)展，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量與心肌細(xì)胞功能相適應(yīng)的細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、糖原等(結(jié)果未顯示)。分化至晚期階段，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以看到大量成束的肌絲，新生的“Z線”及細(xì)胞間的橋粒和緊密聯(lián)接等連接結(jié)構(gòu)，此時(shí)肌絲具有肌節(jié)的功能，電鏡超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果進(jìn)一步說明誘導(dǎo)mESCs分化細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與正常心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)相似。

Figure 6.The effect of CaSR activation on differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes. Expression of cardiac-specific marker protein cTnI expression in the EBs by flow cytometry. The red dots indicate cTnI-positive cells (in R2 region). The X-axis and Y-axis corresponded to the fluorescence intensity and the number of cells per channel (events), respectively.

圖6CaSR活化對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響

Figure 7.The effect of CaSR activation on GATA-4 and Nkx2.5 expression.n=3.★P<0.05vscontrol group.

圖7CaSR活化對(duì)GATA-4和Nkx2.5表達(dá)的影響

ESCs分化為心肌細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要多種信號(hào)活動(dòng)的協(xié)調(diào)[8]。大量轉(zhuǎn)錄因子均參與了心臟發(fā)育過程的調(diào)控, 如GATA-4、 Nkx2.5、Pitx2等。其中Nkx2.5、GATA-4是影響心臟發(fā)育2個(gè)最為重要的轉(zhuǎn)錄因子，且二者具有協(xié)同作用，調(diào)控著眾多下游基因的準(zhǔn)確表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中采用Western blot法檢測了ICA誘導(dǎo)mESCs分化不同時(shí)段二者蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示在細(xì)胞分化早期即在貼壁誘導(dǎo)1 d都有表達(dá)，5 d達(dá)到高峰，在依次檢測的各個(gè)時(shí)點(diǎn)，表達(dá)雖然有下降，但仍保持著高表達(dá)狀態(tài)。由此可以證明，心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4在mESCs向心肌細(xì)胞分化早期即有表達(dá)，從而激活其它如ANF、心臟α-actinin等基因的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞的繼續(xù)分化和完善。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western blot 檢測CaSR在分化不同時(shí)點(diǎn)的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Nkx2.5和GATA-4的表達(dá)情況類似，在分化第 5天 CaSR蛋白表達(dá)最高，其它時(shí)點(diǎn)表達(dá)量有所降低，但仍保持較高水平。因此判斷CaSR在mESCs向心肌細(xì)胞分化早期發(fā)揮其作用。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能和器官發(fā)育。已有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)Ca2+通過CaSR在多種細(xì)胞的分化和增殖中發(fā)揮重要作用[9-11]。為了觀察CaSR活性改變對(duì)mESCs向心肌細(xì)胞分化的影響，本研究根據(jù)分化細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)CaSR蛋白的表達(dá)情況，選擇了在貼壁培養(yǎng)的1 d分別加入CaSR激動(dòng)劑新霉素和抑制劑NPS-2390作為干擾因素，探討CaSR在mESCs向心肌細(xì)胞分化中的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，和ICA組相比，新霉素能顯著增加心肌細(xì)胞跳動(dòng)率、cTnI陽性細(xì)胞的百分比及早期分化細(xì)胞中CaSR、Nkx2.5和GATA-4蛋白的表達(dá)，但上述效應(yīng)可以被NPS-2390抑制。這些結(jié)果提示CaSR激活能促進(jìn)mESCs向心肌細(xì)胞的分化，并且是通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

總而言之，本部分研究說明在mESCs向心肌細(xì)胞分化的過程，激活CaSR可以通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4表達(dá)而促進(jìn)定向轉(zhuǎn)化，為如何提高ESCs細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的分化率，提供了一個(gè)有價(jià)值的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Roles of calcium sensing receptor in icariin-induced differentiation of mouse embryonic stem cells to cardiomyocyteSUN Jian1, BAI Shu-zhi2, LI Shuang1, XU Xiao-yi1, YUAN Hui1, WEI Tao1, XU Chang-qing2, LUAN Hai-rong1

(1MudanjiangMedicalCollege,Mudanjiang157011,China;2DepartmentofPathophysiology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China.E-mail:vivian7835@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the effect of calcium sensing receptor (CaSR) on icariin (ICA) induced mouse embryonic stem cells (mESCs) to differentiate into cardiomyocytesinvitro. METHODS: mESCs were cultured to embryoid bodies (EBs) by direct suspension method and the differentiation of EBs into cardiomyocytes was induced by ICA. The expression of cardiac specific proteins α-actinin and cardiac troponin-I (cTnI) was analyzed by Western blot and immunofluorescence. The differentiation rate was determined by flow cytometry. The ultrastructure of the derived cardiomyocytes was further characterized by transmission electron microscopy. The expression of cardiac-specific transcription factors Nkx2.5 and GATA-4,as well as CaSR was detected by Western blot. RESULTS: After induction with ICA, the positive characteristics of myocardial cells appeared in the EBs cultured for 2 d. The expression of cardiac-specific sarcomeric protein actinin (α-actinin) and cTnI showed an overall upward trend by Western blot in different phases of ICA induced differentiation. The expression of CaSR, Nkx2.5 and GATA-4 was the highest at an early stage of ICA-induced differentiation. Neomycin (an activator of CaSR) up-regulated CaSR, NKx2.5 and GATA-4 expression in the EBs at early stage of ICA-induced differentiation, all of which were reversed by NPS2390 (an inhibitor of CaSR).CONCLUSION: CaSR is functionally expressed in mESC-derived cardiomyocytes, and activation of CaSR is involved in the differentiation of mESCs into cardiomyocytes by facilitating the expression of NKx2.5 and GATA-4.

[KEY WORDS]Calcium sensing receptors; Icariin; Cell differentiation; Cardiomyocyte

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.007

[中圖分類號(hào)]R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 0453-6582302; E-mail: vivian7835@163.com

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81300163； No.81200160)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.12531749； No.12531731)；牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)研究項(xiàng)目(No.IS201308)

[收稿日期]2015- 07- 27[修回日期] 2015- 11- 11

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)02- 0234- 06