呂　穎，　張軍波，　劉仲偉，　張愛峰，　潘軍強，　王軍奎，　潘　碩，　韓穩(wěn)琦，　孫超峰△

(1陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科，陜西 西安 710068；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710061；3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710004)

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細(xì)胞外鉀對HERG基因無義突變L539fs/47表達(dá)的調(diào)控*

呂穎1，張軍波2，劉仲偉1，張愛峰3，潘軍強1，王軍奎1，潘碩1，韓穩(wěn)琦2，孫超峰2△

(1陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科，陜西 西安 710068；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710061；3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710004)

[摘要]目的： 研究持續(xù)細(xì)胞外鉀對野生型HERG與其突變體L539fs/47蛋白表達(dá)的影響。方法: 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將野生型HERG(WT)及其突變體HERG-L539fs/47(MT)分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞36 h后，0.8、4.3及10 mmol/L的鉀干預(yù)6 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測HERG蛋白表達(dá)量；干預(yù)12 h用激光共聚焦成像和免疫印跡法進(jìn)行HERG蛋白定位及表達(dá)量檢測。結(jié)果: 用激光共聚焦成像檢測發(fā)現(xiàn)野生型HERG蛋白主要分布在細(xì)胞膜上；而HERG突變體L539fs/47蛋白大部分滯留胞漿；并且HERG蛋白的表達(dá)均隨細(xì)胞外鉀濃度升高而增多。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示細(xì)胞外高鉀組熒光增多(P<0.01)，WT組熒光陽性細(xì)胞百分比和熒光強度均高于MT組(P< 0.05)。免疫印跡顯示，不同于野生型 HERG 135 kD及155 kD 2個條帶，突變體僅60 kD 1個條帶，3個條帶均受細(xì)胞外鉀影響(P< 0.05)。結(jié)論: 細(xì)胞外高鉀增強細(xì)胞膜上野生型和突變型HERG通道蛋白的穩(wěn)定性，持續(xù)低鉀干預(yù)時間依賴性地減少HERG通道蛋白的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]HERG基因； 無義突變； 細(xì)胞外鉀； HEK293細(xì)胞

心臟離子通道病先天性長QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)是一種由于編碼心肌離子通道蛋白的基因突變導(dǎo)致心肌細(xì)胞復(fù)極異常而引起的臨床綜合征，常見年輕人的家族性惡性室性心律失常，表現(xiàn)為尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(torsades de pointes，TdP)、暈厥和猝死。受關(guān)注藥物引起的LQTS其發(fā)生亦具有遺傳背景[1]。LQTS的患病率為1/2 500至1/2 000，分為LQT1～LQT13亞型。我國以LQT2為主，占已知LQTS的45 %[2]。

快速激活延遲整流鉀通道(rapid delayed rectifier potassium channel， IKr)在心臟動作電位復(fù)極化過程中發(fā)揮重要作用，其突變導(dǎo)致LQT2。HERG基因編碼IKr的α亞基形成四聚體后，與β亞基共同組成IKr。HERG蛋白在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中核心糖基化成135 kD大小，再經(jīng)過高爾基體進(jìn)一步復(fù)合糖基化為155 kD成熟蛋白，組裝成四聚體后轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜，發(fā)揮生理功能；每個α亞基有6個跨膜片段、1個孔區(qū)以及氨基和羧基末端[1]。2007年[3]從一個LQTS家系中發(fā)現(xiàn)了父系遺傳的HERG第7外顯子cDNA第1 619～1 637核苷酸位點存在缺失突變，導(dǎo)致位于第586位氨基酸提前出現(xiàn)終止密碼子，產(chǎn)生大片段丟失的截短蛋白質(zhì)，肽鏈終止于S4區(qū)域前，命名為L539fs/47。

在病理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞外以低鉀為主的慢性電解質(zhì)紊亂很常見。既往對鉀離子與LQT2的研究多集中在快速增加細(xì)胞外K+以減少HERG通道的失活，造成功能降低方面，以及近年來還發(fā)現(xiàn)生理濃度范圍內(nèi)提高細(xì)胞內(nèi)K+濃度能穩(wěn)定HERG通道蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出。這2種機(jī)制的差異提出了一個重要的問題[4]，即目前多研究急性低鉀是否直接引起HERG功能抑制，而忽略了抑制HERG蛋白轉(zhuǎn)運的因素，對使已經(jīng)成功轉(zhuǎn)運到膜上的HERG蛋白向細(xì)胞內(nèi)逆向轉(zhuǎn)運、降解的環(huán)境及藥物因素鮮有研究。另外，對細(xì)胞外鉀濃度持續(xù)變化時HERG離子通道蛋白表達(dá)時間相關(guān)的調(diào)控研究甚少，對鉀濃度持續(xù)改變下HERG突變體蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)運的研究值得關(guān)注。

材料和方法

1試劑和儀器

質(zhì)粒野生型pcDNA3-HERG (WT) 和突變體pcDNA3-L539fs/47(MT)由本實驗室張愛峰博士提供；pEGFP-C2-WT(本實驗室霍建華博士提供)；pEGFP-C2-MT(本實驗室前期自行構(gòu)建[5])；pDsRed2-ER(Clontech)；HEK293細(xì)胞(本實驗室提供)；含4.3 mmol/L鉀離子的高糖型DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(HyClone)；X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑(Roche)；兔抗人HERG-N端單克隆抗體(Sigma)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG II 抗(Thermo)；其它均為國產(chǎn)分析純試劑。低鉀(0.8 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基采用高糖型DMEM培養(yǎng)基，選用國產(chǎn)分析純試劑配制：添加氯化鉀74.42 mg，溶解于1 L去離子水中，補加3.7 g NaHCO3，混勻后分別加入0.1 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，將pH值調(diào)至7.2，經(jīng)雙層0.22 μm濾膜過濾除菌后，分裝后-20 ℃冰箱保存。配制高鉀(10 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基：正常鉀濃度的DMEM 100 mL加入10% KCl 435 μL。

TCS SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica)；FASCalibur流式細(xì)胞儀；2000型凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM高糖型培養(yǎng)基加10%胎牛血清在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)HEK293細(xì)胞。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染6孔板中HEK293細(xì)胞密度調(diào)整至40%～50%后，F(xiàn)uGENE? HD轉(zhuǎn)染劑(質(zhì)粒總量選取4 μL∶2 μg比例轉(zhuǎn)染)。

2.3激光共聚焦成像在96孔板中，將pEGFP-C2-MT(綠色)或pEGFP-C2-WT(綠色)0.75 μg、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)指示質(zhì)粒pDsRed2-ER(紅色)0.25 μg、無血清DMEM 50 μL和轉(zhuǎn)染劑1 μL室溫預(yù)混孵育15 min，加入HEK293細(xì)胞的24孔板中。轉(zhuǎn)染36 h后，分為3組，分別換成含10%胎牛血清的低鉀(0.8 mmol/L)、正常鉀(4.3 mmol/L)和高鉀(10 mol/L)DMEM培養(yǎng)基孵育12 h后，4%的多聚甲醛固定；碳酸甘油緩沖液封片后，分別用波長488 nm和633 nm激光分別激發(fā)綠色和紅色熒光，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.4流式細(xì)胞計數(shù)35 mol/L培養(yǎng)皿中HEK293細(xì)胞貼壁生長至60%～70%時，轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-WT或pEGFP-C2-MT后36 h，3組不同鉀濃度(0.8、4.3和10 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基孵育6 h，消化后用PBS懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度1×105～1×107/L，流式細(xì)胞術(shù)檢測EGFP-WT或EGFP-MT融合蛋白的表達(dá)量。

2.5免疫印跡實驗將pcDNA3-WT或pcDNA3-WT+pcDNA3-MT轉(zhuǎn)染進(jìn)野生組及雜合組HEK293細(xì)胞36 h后，3種濃度鉀干預(yù)12 h，提取蛋白變性后保存。濃縮膠80 V，20～30 min，8 %分離膠120 V，60～90 min，兔抗人 I 抗(1∶200稀釋)，4 ℃過夜，TBST稀釋HRP標(biāo)記的 II 抗(山羊抗兔 II 抗1∶3 000稀釋)，室溫2 h，HRP化學(xué)發(fā)光法顯影。

3統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示， WT組和WT+MT組間比較采用t檢驗；各濃度亞組間采用單因素方差分析，各亞組之間兩兩比較用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1激光共聚焦成像檢測野生型及突變HERG蛋白的定位

pEGFP-C2-WT和pEGFP-C2-MT分別與特異性定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的pDsRed2-ER共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(圖1)，HERG-WT和HERG-MT分別與EGFP形成融合蛋白后，經(jīng)藍(lán)光模式激發(fā)顯示細(xì)胞膜呈綠色光滑線型熒光圖像，分別與pDsRed2-ER質(zhì)粒(紅色，僅在胞漿的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá))重疊后，可見“綠包紅”(綠色熒光包繞在紅色熒光外周)。EGFP-WT融合蛋白綠色熒光主要位于細(xì)胞膜上；表達(dá)的EGFP-MT截短突變蛋白熒光部分位于胞漿中，部分位于細(xì)胞膜上。突變通道蛋白膜分布減少，胞質(zhì)內(nèi)蛋白增加，且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位，說明突變通道蛋白由于轉(zhuǎn)運障礙而部分被滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。

Figure 1.Localization of WT and MT EGFP-HERG fusion channel proteins by laser scanning confocal microscopy.

圖1激光共聚焦顯微鏡定位野生型及突變型EGFP-HERG融合通道蛋白

2激光共聚焦成像檢測不同細(xì)胞外鉀濃度干預(yù)后野生型及突變HERG蛋白的表達(dá)

低、中、高3組細(xì)胞外鉀干預(yù)12 h后，高鉀組EGFP-WT蛋白在細(xì)胞膜上分布最多；高鉀組EGFP-MT截短突變蛋白表達(dá)亦最多，見圖2。

Figure 2.The expression of EGFP-MT and EGFP-WT under different concentrations of extracellular potassium detected by green fluorescence.

圖2綠色熒光顯示不同細(xì)胞外鉀濃度下EGFP-WT及EGFP-MT的表達(dá)

3流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

pEGFP-C2-WT及pEGFP-C2-MT轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞36 h，再經(jīng)0.8、4.3和10 mmol/L 3個濃度鉀干預(yù)6 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明EGFP-WT的陽性細(xì)胞百分比和熒光強度均高于EGFP-MT的陽性細(xì)胞。通道右側(cè)信號的熒光強度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)熒光強度越高。WT組與MT組間比較，WT組EGFP熒光陽性細(xì)胞百分比和熒光強度均高于MT組(P<0.05)。WT組和MT組EGFP熒光陽性細(xì)胞百分比均隨細(xì)胞外鉀濃度升高而增多(P<0.01)；WT組和MT組GFP熒光強度也隨鉀濃度升高而增多(P< 0.01)。此外，各不同濃度鉀處理組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3、4。

Figure 3.The percentage of positive cells and fluorescence intensity of EGFP-HERG under different concentrations of extracellular potassium detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.#P<0.05vsMT;**P<0.01vs0.8 mmol/L K+;△△P<0.01vs4.3 mmol/L K+.

圖3不同細(xì)胞外鉀濃度下EGFP-HERG陽性細(xì)胞百分比和熒光強度的變化

4Western blot實驗結(jié)果

代表野生型HERG 2次糖基化的155 kD和135 kD條帶及代表突變體L539fs/47的60 kD條帶在高鉀組表達(dá)最多。低鉀組155 kD及60 kD條帶幾乎消失，見圖4。

Figure 4.HERG protein bands of WT and WT+MT groups under different concentrations of extracellular potassium detected by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0.8 mmol/L K+.

圖4不同細(xì)胞外鉀濃度下WT和WT+MT組HERG蛋白的表達(dá)

討論

自從Fisch于1973年首次提出了電解質(zhì)和心律失常的相關(guān)性以來，大量研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外低鉀與LQT相關(guān)。早前發(fā)現(xiàn)低鉀可誘發(fā)85%小鼠產(chǎn)生心肌早期后除極。林加鋒等[6]對64例發(fā)生室性早搏誘發(fā)的惡性快速性室性心律失?；颊哐芯浚l(fā)現(xiàn)43.8%是由低鉀低鎂血癥伴LQTS誘發(fā)；嚴(yán)重低鉀血癥時，溫和的LQTS突變可能表現(xiàn)出臨床癥狀。

ACC、AHA和ESC 2006室性心律失常治療與心臟猝死預(yù)防指南對于藥物引起的心律失常建議補鉀治療，將血鉀維持4 mmol/L以上(推薦等級Ⅱa、證據(jù)等級C)[7]。2010年進(jìn)一步建議將血鉀維持在4.5～5.0 mmol/L左右[8]。補鉀提高血清鉀水平可能對LQTS患者治療有益，尤其是在LQT2患者[9]。通過短期及長期[9]補充外源性鉀可改善受損的IKr功能，增加外向鉀電流和縮短復(fù)極，糾正LQT2患者復(fù)極時間、QT離散度等心電圖異常表現(xiàn)。補鉀治療也可能是對一些獲得性LQTS的治療有效[10]。

既往細(xì)胞層面對鉀離子與LQT2的研究多集中在快速增加細(xì)胞外K+以減少HERG通道的失活，促使可用性通道的數(shù)目增加，從而增大電流，近年來還發(fā)現(xiàn)生理濃度范圍內(nèi)提高細(xì)胞內(nèi)K+濃度可穩(wěn)定HERG通道蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出[11]。而慢性細(xì)胞外鉀濃度與HERG離子通道蛋白表達(dá)時間相關(guān)的調(diào)控研究甚少。

與Zhang等[12]的研究一致，L539fs/47蛋白可表達(dá)于細(xì)胞膜，部分滯留于胞漿。與既往研究不同的是，Guo等[13]近年來證實細(xì)胞外K+濃度對通道失活的調(diào)節(jié)作用有限；急性細(xì)胞外低鉀時，HERG通道進(jìn)入了一種新的“不導(dǎo)電狀態(tài)”，不同于電壓依賴失活狀態(tài)及藥物阻滯狀態(tài)。此外，這種不導(dǎo)電狀態(tài)繼而觸發(fā)細(xì)胞表面的鉀通道快速向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運及降解。由于門控狀態(tài)與HERG通道細(xì)胞膜穩(wěn)定性之間的直接聯(lián)系，他們首次提出細(xì)胞表面的HERG蛋白密度是由細(xì)胞外鉀調(diào)控。進(jìn)一步研究更為重要的持續(xù)低鉀對HERG通道的影響揭示，在家兔心臟和人類HEK293細(xì)胞系中，0 mol/L的細(xì)胞外鉀濃度負(fù)性控制細(xì)胞表面HERG蛋白表達(dá)量。共聚焦成像分析表明在向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程中，細(xì)胞外低鉀促進(jìn)泛素過度表達(dá)，通道蛋白被聚集到溶酶體，HERG蛋白發(fā)生降解?；謴?fù)細(xì)胞外的鉀濃度至5 mmol/L，HERG通道的“不導(dǎo)電狀態(tài)”及向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運狀態(tài)均可逆，可以重新獲得細(xì)胞膜上的功能性通道；而已進(jìn)入降解程序的通道蛋白無法恢復(fù)。

本研究中激光共聚焦成像、流式細(xì)胞術(shù)及免疫印跡結(jié)果均支持細(xì)胞外鉀濃度是HERG通道功能和膜穩(wěn)定性的先決條件，細(xì)胞外相對高鉀可以防止HERG通道進(jìn)入不導(dǎo)電狀態(tài)，從而保持蛋白停留在細(xì)胞膜。低鉀時野生及突變的3個條帶表達(dá)均較正常鉀組明顯減少，同慢性低鉀促使通道蛋白向細(xì)胞內(nèi)逆向轉(zhuǎn)移及繼發(fā)降解有關(guān)。而高鉀時3個條帶表達(dá)均較正常鉀組明顯增多，除抑制逆向轉(zhuǎn)運及繼發(fā)降解外，還可能與高鉀穩(wěn)定HERG蛋白結(jié)構(gòu)并促進(jìn)前向轉(zhuǎn)運至膜上，避免被降解相關(guān)。此外，低鉀介導(dǎo)HERG通道蛋白的構(gòu)像缺陷，阻斷HERG轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜。如Wang等[11]發(fā)現(xiàn)強心甙過夜孵育，通過直接抑制Na+-K+-ATP酶，耗盡細(xì)胞內(nèi)K+，誘發(fā)LQTS，而通過滲透作用增加細(xì)胞內(nèi)的K+或 Rb+，可以恢復(fù)HERG轉(zhuǎn)運。

細(xì)胞外持續(xù)低鉀促使通道蛋白時間依賴性向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，0 mol/L 細(xì)胞外鉀培養(yǎng)下可在3 h內(nèi)使HERG完全內(nèi)化，在4 h內(nèi)開始降解，12 h降解達(dá)峰，使轉(zhuǎn)染野生型HERG的HEK細(xì)胞IKr密度降低，電流減少[14]。與此一致，本研究中免疫印跡發(fā)現(xiàn)低鉀干預(yù)12 h后155 kD和60 kD蛋白從細(xì)胞膜上向胞漿中轉(zhuǎn)運后充分降解，而低鉀干預(yù)6 h后流式細(xì)胞術(shù)顯示蛋白部分降解，未達(dá)到峰值[14]。

簡言之，細(xì)胞膜上的通道密度是全細(xì)胞電流大小的一個關(guān)鍵性決定因素。本研究通過激光共聚焦成像觀察證實HERG大片段無義突變體L539fs/47部分滯留胞漿，部分糖基化后可能與HERG-WT形成異源四聚體，定位于細(xì)胞膜上；再通過激光共聚焦成像、流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡證實，同HERG-WT一樣，細(xì)胞外相對高鉀增強HERG-L539fs/47穩(wěn)定性，使其在細(xì)胞膜分布增多；而慢性低鉀干預(yù)時間依賴性地減少HERG通道蛋白表達(dá)。研究細(xì)胞外鉀離子相對慢性的調(diào)節(jié)過程中突變HERG通道的蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)運及功能的改變，可能為臨床低鉀誘發(fā)LQT2惡性心律失常的機(jī)制研究及治療提供分子生物學(xué)證據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of extracellular potassium on expression ofHERGgene nonsense mutant L539fs/47Lü Ying1, ZHANG Jun-bo2, LIU Zhong-wei1, ZHANG Aai-feng3, PAN Jun-qiang1, WANG Jun-kui1, PAN Shuo1, HAN Wen-qi2, SUN Chao-feng2

(1TheFirstDepartmentofCardiovascularMedicine,ShanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;2DepartmentofCardiovascularMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;3DepartmentofCardiovascularMedicine,TheSecondAffiliatedHospital,MedicalCollegeofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China.E-mail:csun1@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the effects of extracellular potassium on the protein expression of wild- type HERG and its mutant L539fs/47. METHODS: Wild-type HERG (WT) or its mutant HERG-L539fs/47 (MT) were transfected into HEK293 cells for 36 h. The cells were incubated in different media containing 0.8, 4.3 or 10 mmol/L potassium. After 6 h of incubation, the protein expression of HERG was detected by flow cytometry.After 12 h of incubation, the localization and quantity of the proteins were detected by laser confocal imaging and Western blot. RESULTS: Different from the retention of mutant protein in cytoplasm, wild-type HERG protein was mainly distributed in the cell membrane. The 2 proteins both increased with the changes of extracellular potassium. Flow cytometry showed that the fluorescence in the 2 groups both increased with the changes of extracellular potassium (P<0.01). The fluorescence in WT group was significantly higher than that in MT group (P<0.01). Western blot showed that mutant HERG protein included only one 60 kD band, different from the 135 kD and 155 kD bands in wild-type HERG, which were affected by the changes of extracellular potassium (P<0.05). CONCLUSION: The retention of HERG mutant L539fs/47 protein in the cytoplasm is more than wild-type HERG. Chronic high extracellular potassium keeps the stability of wild-type and mutant HERG proteins on the cell membrane. Chronic low potassium reduces the expression of HERG channel proteins in a time-dependent manner.

[KEY WORDS]HERGgene; Nonsense mutation; Extracellular potassium; HEK293 cells

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.006

[中圖分類號]R541.7； R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 029-85323809; E-mail: csun1@163.com

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 30800473)

[收稿日期]2015- 06- 03[修回日期] 2015- 12- 24

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0228- 06