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        5種江西特色盆景植物根際微生物群落特征比較研究

        2016-03-04 09:22:11毛坤財(cái)鄒貴武鄧光華
        森林工程 2016年1期

        毛坤財(cái),鄒貴武,鄧光華,劉 瑋

        (1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與藝術(shù)學(xué)院,南昌,330045;2.江西省林業(yè)干部培訓(xùn)中心,南昌,330045)

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        5種江西特色盆景植物根際微生物群落特征比較研究

        毛坤財(cái)1,2,鄒貴武1,鄧光華1,劉瑋*

        (1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與藝術(shù)學(xué)院,南昌,330045;2.江西省林業(yè)干部培訓(xùn)中心,南昌,330045)

        摘要:應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)方法對(duì)三葉赤楠、火棘、三角楓、雞爪槭和金邊瑞香這5種江西特色盆景樹種根際微生物特征進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明:PCR-DGGE對(duì)于盆景樹種根際微生物特征響應(yīng)良好,DGGE圖譜可以明顯反映出5種盆景樹種根際微生物的差異。不同樹種根際微生物特征有很大區(qū)別,雞爪槭、三角楓根際微生物多樣性指數(shù)最高,為3.121和2.876,并且根際微生物群落相似程度很高;而火棘根際微生物多樣性指數(shù)最低,為1.038。這種根際微生物群落的差異可能是由不同盆景植物的根系分泌物差異所造成的,雞爪槭、三角楓根際微生物群落相似可能是由于其系統(tǒng)發(fā)育地位較近(槭樹科槭屬)所造成的。而火棘(薔薇科)根際微生物多樣性較低可能是由于薔薇科植物根系分泌物富含三萜酸類物質(zhì),對(duì)微生物具有抑制作用的原因。

        關(guān)鍵詞:盆景樹種;根際微生物多樣性;PCR-DGGE分析

        引文格式:毛坤財(cái),鄒貴武,鄧光華,等.5種江西特色盆景植物根際微生物群落特征比較研究[J].森林工程,2016,32(1):33-36.

        0引言

        盆景是以植物、山石等材料,經(jīng)過藝術(shù)創(chuàng)作和園藝栽培,將自然界的優(yōu)美景色集中、典型地在盆中進(jìn)行塑造,是我國優(yōu)秀的傳統(tǒng)藝術(shù)之一[1]。目前對(duì)于盆景植物的研究多集中于栽培、造型和風(fēng)格鑒賞等領(lǐng)域[2-3],而關(guān)于盆景植物根際微生物生態(tài)學(xué)的研究只有少數(shù)報(bào)道[4]。由于根際微生物在地上植物生長(zhǎng)、養(yǎng)分吸收及抗性形成方面起著重要的反饋調(diào)控作用,因此研究盆景植物根際微生物的群落特征及變化趨勢(shì)對(duì)于提高盆景養(yǎng)護(hù)水平,促進(jìn)這一古老藝術(shù)形式的繼承發(fā)展有著現(xiàn)實(shí)的意義。傳統(tǒng)根際微生物學(xué)研究主要采用平板涂布、氯仿熏蒸等方法來測(cè)定土壤微生物生物量、基礎(chǔ)呼吸和可培養(yǎng)微生物區(qū)系等[5-6],而這些方法只能提供部分根際微生物功能、群落等信息,具有一定的局限性。近年來分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛發(fā)展、應(yīng)用,為根際微生物的研究提供了更為便利和清晰的方法手段。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技術(shù)是基于核糖體DNA的保守序列設(shè)計(jì)出不同微生物類群的特異性引物,并通過相關(guān)的分子生物學(xué)測(cè)定技術(shù)研究其群落特征[7-8]。本研究采用PCR-DGGE方法,對(duì)五種江西常見盆景植物:三葉赤楠(Syzygiumgrijsii,桃金娘科蒲桃屬,后文簡(jiǎn)寫為Sg)、火棘(Pyracanthafortuneana,薔薇科火棘屬,Pf)、三角楓(Acerbuergerianum,槭樹科槭屬,Ab)、雞爪槭(Acerpalmatum,槭樹科槭屬,Ap)、金邊瑞香(Daphneodora,瑞香科Thymelaeaceae瑞香屬DaphneLinn.植物,Do)的根際微生物特征進(jìn)行研究,這5種植物在生長(zhǎng)習(xí)性,根系結(jié)構(gòu)及根系分泌物組成方面均有很大的區(qū)別。觀察盆栽條件下這幾種江西特色盆景樹種根際微生物的差異與變化,希望能從根際微生物調(diào)控方面找到一些改善盆景樹種生長(zhǎng)、提高觀賞價(jià)值的新途徑。

        1材料與方法

        1.1樣品采集與處理

        供試植物為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉盆景教學(xué)基地栽培的三葉赤楠、火棘、雞爪槭、三角楓和金邊瑞香盆樁,樹齡30~50a不等,但上盆栽培時(shí)間均為5a,且每樹種所取個(gè)體樹齡相仿。各品種盆樁管理方式一致,施用肥料以充分發(fā)酵的餅肥為主,施用量一致。

        按照劉瑋等[4]的方法,每樹種取三株個(gè)體的根際土壤混合,揀去植物殘?bào)w,在田間含水量條件下過2mm篩,在-20℃條件下冷凍保存,以備后續(xù)DNA提取及相關(guān)分子生物學(xué)分析使用。

        1.2土壤DNA提取及PCR擴(kuò)增

        盆景植物由于其養(yǎng)護(hù)方式,土壤多呈褐色及棕色,腐殖質(zhì)類物質(zhì)含量較高,而土壤中較多的腐殖質(zhì)對(duì)于后續(xù)的PCR反應(yīng)具有抑制作用,因此本試驗(yàn)土壤樣品在提取DNA前要先進(jìn)行脫腐洗滌[4],洗滌后的土壤樣品DNA采用FastDNA Spin Kit for Soil(Bio 101,Carlsbad,CA,USA)試劑盒按照說明書從0.5 g土壤樣品中進(jìn)行提取。提取后的土壤DNA采用NanoDrop ND-8000(NanoDrop,Wilmington,USA)微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度及質(zhì)量測(cè)定。在本試驗(yàn)中,采用細(xì)菌特異性引物GC-338F和518R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9],目標(biāo)DNA片段長(zhǎng)度約為340 bp。PCR反應(yīng)體系及條件按照劉有勝等[10]以及劉瑋等[4]的方法并加以改進(jìn)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1 % 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)后具有明顯目標(biāo)條帶的PCR產(chǎn)物用QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN,Beijing,China)純化后保存于-20℃待用。

        1.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳分析(PCR-DGGE)

        采用美國伯樂(Bio-Rad)公司的DcodeTM的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)不同盆景植物根際土壤PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1×TAE的電泳緩沖液中進(jìn)行電泳分離,凝膠變性梯度為30%~65%,電泳溫度為60℃,電壓130 V電泳時(shí)間12 h。電泳結(jié)束后用SYBR GreenⅠ核酸染料染色30 min,在清水中退染20 min,然后用Bio-Rad Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。采用Quantity One 2.0(Bio-rad,USA)軟件對(duì)根際土壤微生物群落的PCR-DGGE圖譜進(jìn)行分析,在去除背景噪音后檢測(cè)不同樣品電泳條帶的數(shù)量和亮度峰值,通過圖像分析軟件分析凝膠圖像數(shù)字化后16S rRNA基因的指紋圖譜。

        1.4數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)

        本研究中,根際土壤細(xì)菌群落的物種豐富度(S)、Shannon-Weiner多樣性指數(shù)(H′)以及均勻度指數(shù)(E)用來表征樣品中細(xì)菌類群的多樣性狀況[11]。物種豐富度S以DGGE譜圖中有效條帶的數(shù)量(經(jīng)過校正),均勻度指數(shù)E表征不同樣品根際土壤群落中條帶的均勻度情況,即各細(xì)菌類群之間的分配情況。

        排序分析及假設(shè)檢驗(yàn)都用CANOCO for windows v.4.5軟件完成[12],數(shù)據(jù)在進(jìn)行PCA分析時(shí)沒有進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

        2試驗(yàn)結(jié)果

        2.1不同盆景植物根際微生物群落PCR-DGGE分析結(jié)果

        經(jīng)過脫腐洗滌后,減少了胞外DNA和腐殖質(zhì)類物質(zhì)的污染與干擾,土壤DNA的提取效果較好,所提取的土壤DNA條帶明亮、清晰,經(jīng)純化后可直接用于PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約為340 bp,無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。變性梯度凝膠電泳圖譜分析表明,PCR-DGGE方法對(duì)于盆景樹種的根際細(xì)菌類群具有很高的分辨率,不同盆景樹種根際土壤DNA樣品經(jīng)DGGE電泳后分離出不同數(shù)量、強(qiáng)度和位置的條帶,代表著具有不同16S rDNA序列解鏈特性的細(xì)菌類群[13],條帶越多證明細(xì)菌類群越多。經(jīng)過變性梯度凝膠電泳,雞爪槭樣品分離出的條帶數(shù)最多,為26條;其次是三角楓和金邊瑞香,為19條;火棘樣品和三葉赤楠樣品的條帶數(shù)較少,只有3條和5條。不同盆景植物樣品根際土壤DNA的電泳條帶強(qiáng)度及遷移率也存在一定程度差異,表明樹種差異是造成盆景植物根際細(xì)菌群落種群變化的主要原因。

        主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)被用來描述不同盆景植物土壤樣品中細(xì)菌類群的分布特征(如圖1所示),PCA分析結(jié)果表明盆景植物種類對(duì)土壤細(xì)菌群落具有顯著的影響,不同盆景植物根際土壤細(xì)菌群落出現(xiàn)了明顯的位置分化,在橫軸上主要是由槭屬的雞爪槭、三角楓和桃金娘科的三葉赤楠、薔薇科的火棘根際微生物差異所導(dǎo)致,而在縱軸上的差異則主要由瑞香科的金邊瑞香構(gòu)成:在三葉赤楠(Sg)和火棘(Pf)周圍土壤細(xì)菌條帶很少,說明這些植物根際土壤中微生物的類群相對(duì)較少;雞爪槭(Ap)和三角楓(Ab)距離相對(duì)較近,在它們周圍的條帶也相近,如6、7、8、9、11、13、15、16、21、25、29、30,說明這兩種盆景植物的根際微生物類群組成較為接近,相同的微生物類群較多。金邊瑞香(Do)的根際土壤微生物類群與其他盆景植有很大區(qū)別。說明不同盆景植物根際微生物組成有很大的差異,基本可以分為三部分,其中Ap和Ab根際微生物類群組成較為相近,Sg和Pf根際微生物類群很少,而Do的組成與這兩部分也有很大差異。

        圖1 微生物群落遺傳多樣性的主成分分析(Sg-三葉赤楠;Pf-火棘;Ab-三角楓;Ap-雞爪槭;Do-金邊瑞香);圖中數(shù)字代表不同的微生物類群(不同條帶類型)。Fig.1 PCA analysis of soil microbial communities(Sg-Syzygium grijsii;Pf-Pyracantha fortuneana;Ab-Acerbuergerianum;Ap-Acer palmatum;Do-Daphne odora);different microorganisms groups representby banding type were showed by numbers in figure.

        2.2盆景植物對(duì)根際土壤微生物群落豐富度及多樣性特征影響

        盆景植物種類對(duì)根際土壤細(xì)菌群落多樣性特征的影響不同(見表1):不同盆景植物根際土壤細(xì)菌群落的豐富度及多樣性特征發(fā)生了明顯變化,雞爪槭(Ap)的物種豐富度及多樣性指數(shù)最高,分別為26和3.121;三角楓(Ab)和金邊瑞香(Do)的物種豐富度及多樣性指數(shù)數(shù)值接近次之,分別為19(Ab)、19(Do)和2.876(Ab)、2.873(Do);火棘(Pf)的物種豐富度和多樣性指數(shù)最低,只有3和1.038。

        表1 不同盆景植物根際土壤細(xì)菌群落多樣性特征

        3討論

        以往對(duì)于盆景植物的研究多著重于造型修剪以及栽培技術(shù),關(guān)于栽培生理方面的研究極少,而對(duì)于盆景植物根際微生態(tài)的研究幾乎沒有。根際微生物是植物-土壤微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在植物養(yǎng)分循環(huán)過程中起著重要的作用[14-15]。因此通過根際微生物的研究可以了解盆景植物-土壤微生態(tài)系統(tǒng)的協(xié)同關(guān)系,為盆景植物的高效培育提供依據(jù)[16]。

        物種多樣性是指群落中物種數(shù)目的多少,它是衡量群落規(guī)模和重要性的基礎(chǔ)。種類越多,各種個(gè)體數(shù)量分布越均勻,物種多樣性指數(shù)越大。在DGGE圖譜中,每一個(gè)DGGE條帶代表的并不是一種微生物,而是一類微生物[17]。本研究被分離的每一個(gè)條帶代表樣品微生物群落中的一個(gè)細(xì)菌類群,條帶的深淺則代表了這種細(xì)菌類群的多少和豐富程度[18]。不同植物類型對(duì)于根際微生物類群影響也不相同,雞爪槭的多樣性指數(shù)最高,為3.121;三角楓和金邊瑞香次之,為2.876和2.873;火棘的多樣性指數(shù)最低,只有1.038(表1)。雞爪槭樣品條帶數(shù)最多,為26條;其次是三角楓和金邊瑞香,為19條;火棘樣品的條帶數(shù)最少,為3條。供試樣品間具有許多共同的條帶,說明不同植物間存在一些共有的微生物類型。這些公共條帶的強(qiáng)度也各不相同,表明不同植物間相同微生物類群在數(shù)量水平上也有區(qū)別。不同盆景植物的根際微生物類群及數(shù)量不同,有可能是受植物凋落物分解及植物根際分泌物的影響。在之前的一些研究中發(fā)現(xiàn)在盆栽試驗(yàn)中混入土壤的凋落物對(duì)于根際微生物的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響[19]。但是由于盆景植物的特殊養(yǎng)護(hù)手段,凋落物幾乎不會(huì)在土表存留,因此對(duì)盆景植物根際微生物群落來說,根系分泌物的種類和數(shù)量可能影響更大,并可能對(duì)根際微生物的生長(zhǎng)繁殖及代謝過程產(chǎn)生影響[219。例如有研究表明茄科植物番茄的根際分泌物對(duì)叢枝菌根真菌Gigasporagigantean和Gigasporaintraradices的菌絲生長(zhǎng)有很大的影響[20]。根系分泌物不但對(duì)微生物的生物量產(chǎn)生積極作用,并且對(duì)微生物群落的構(gòu)成產(chǎn)生重要影響。例如隨著小麥(Triticumaestivum)生長(zhǎng)過程中根系分泌物的增加,根際環(huán)境中反硝化細(xì)菌的數(shù)量明顯增加[21],另外小麥根系分泌物中的酚酸還具有抗菌性,對(duì)于根際微生物還具有一定的篩選作用[22]。

        根際微生物群落物種豐富度及多樣性指數(shù)最高的雞爪槭(Ap,26和3.121)、三角楓(Ab,19和2.876)都是槭樹科槭屬植物,而最少的火棘(Pf,3和1.038)是薔薇科火棘屬植物,因此不同植物種屬間根系分泌物的差異可能是造成根際微生物群落差異的原因,相近種屬植物間根際微生物相似性較高。有研究對(duì)薔薇科4種灌木:Adenostomcisparsifolium(下文簡(jiǎn)稱As)、Cowaniamexicanavar.glaber(Com)、Cercocarpusmontanusvar.glaber(Cem)、Fallugiaparadoxa(Fp)的根系分泌物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)它們共同的主要分泌物為三萜酸類而它們之間又各自有一些差異:其中As和Com的分泌物主要為黃酮苷,As還分泌齊墩果酸;Cem和Fp的分泌物主要為類黃酮化合物[23]。有研究表明冬青科植物細(xì)葉冬青(Ilexintegra)中的三萜酸類化合物對(duì)細(xì)菌和真菌具有抑制作用[24]?;鸺母H微生物的生物類群少的特性可能和三萜酸的分布有關(guān)。雞爪槭和三角楓為親緣關(guān)系較近的樹種,它們之間的根際分泌物在某種程度上,具有一定的相似性,這也導(dǎo)致二者之間的根際微生物相度較高。

        根際微生物群落的動(dòng)態(tài)變化也對(duì)根際生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)產(chǎn)生著反饋?zhàn)饔?,從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育及植被多樣性變化[25]。不同的盆景樹種,其地上的生長(zhǎng)和地下微生物之間存在著不同的互動(dòng)規(guī)律,有研究表明三葉赤楠隨著栽培時(shí)間的增加,土壤微生物多樣性增加,在第4年時(shí)其地下微生物多樣性最高,在第8年時(shí)又有所降低,這就能為三葉赤楠養(yǎng)護(hù)期間的換盆時(shí)間提供更多的依據(jù)[4]。更多的盆景植物的地上部分和地下微生物之間互動(dòng)的關(guān)系和規(guī)律還有待進(jìn)一步的探索。如果能夠充分了解其規(guī)律,且對(duì)盆景植物的栽培管理時(shí)能把其地下微生物的情況納入到考慮的因素之中,則能夠使植物的生長(zhǎng)更加健壯,使其觀賞效果大大提高,達(dá)到事半功倍的效果。

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        Comparison of Rhizosphere Microbial Characteristicsof Five Different Bonsai Plants

        Mao Kuncai1,2,Zou Guiwu1,Deng Guanghua1,Liu Wei1*

        (1.College of Art and Landscape,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045;

        2.Training Center of Forestry Cadres,F(xiàn)orestry Department of Jiangxi Province,Nanchang 330045)

        Abstract:The polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE)method was used to determine the rhizosphere microorganism diversity of five bonsai species includingSyzygiumgrijsii,Pyracanthafortuneana,Acerbuergerianum,Acerpalmatum,andDaphneodora.The results showed that the rhizosphere microorganism had significant differences among the five bonsai species.Electrophoresis lanes obtained by PCR-DGGE were able to reflect the difference.Soil microorganism diversity were higher inAcerpalmatumandAcerpalmatum,with peak diversity index of 3.121 and 2.876,they also had a higher similarity of rhizosphere microbial community.The lowest diversity index was observed inPyracanthafortuneana,and the value was 1.038.These differences in rhizosphere microbial communities may be caused by root exudate secreted from different bonsai plants.Higher similarity of rhizosphere microbial community fromAcerpalmatumandAcerpalmatummay be due to their close phylogenetic position(Aceraceae,Acer).A lower rhizosphere microbial diversity inPyracanthafortuneanamay be due to the root exudate secreted by Rosaceae plant,which contained substances triterpene acids and had inhibitory effect on microorganism.

        Keywords:bonsai species;rhizosphere microorganism diversity;PCR-DGGE analysis

        *通信作者:劉瑋,講師,博士,E-mail: w_liu08@163.com

        作者簡(jiǎn)介:第一毛坤財(cái),工程師,碩士研究生,主要從事園林植物與觀賞園藝學(xué)相關(guān)研究工作。

        基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(31400528);江西省自然科學(xué)基金(20151BAB214018)資助

        收稿日期:2015-10-11

        中圖分類號(hào):S 688.1;S 154.3

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

        文章編號(hào):1001-005X(2016)01-0033-04

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