郭建軍， 袁 林， 曾 靜， 魏國汶， 楊一兵

(江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌 330096)

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多角體包埋異源蛋白桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

郭建軍， 袁 林， 曾 靜， 魏國汶， 楊一兵

(江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌 330096)

摘要[目的]探索多角體病毒的包裝特性，構(gòu)建能形成多角體包裹外源蛋白的polyh+Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)。[方法] 通過酶切連接的方式，將4個(gè)元件片段：作為標(biāo)記的綠色熒光基因EGFP，BmCPV自身的多角體蛋白基因，用于基因表達(dá)的H1信號(hào)肽柔性連接肽， 插入到質(zhì)粒FastBacDual 中，利用AcMNPV Bac-to-Bac系統(tǒng)，得到整合表達(dá)重組Bacmid：Ac-polyh/EGFP。將其感染Sf9細(xì)胞后，檢測蛋白表達(dá)情況。[結(jié)果]利用該系統(tǒng)構(gòu)建了一種能大量表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)和能在胞質(zhì)形成多角體的重組病毒vBmBac(polyh+)-EGFP。感染的Sf9細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)EGFP與多角體可以在同一細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)；從感染的Sf9細(xì)胞中收集純化多角體，觀察到多角體能被激發(fā)出綠色熒光，進(jìn)一步利用Western blot證實(shí)多角體中含有EGFP。[結(jié)論]該表達(dá)系統(tǒng)為解決活性蛋白長期保存提供了新方法，同時(shí)拓寬了桿狀病毒在開發(fā)含有毒素蛋白的新型生物殺蟲劑和新型疫苗的轉(zhuǎn)運(yùn)載體等領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞桿狀病毒；多角體；異源包埋

昆蟲桿狀病毒在其生活史中存在2種結(jié)構(gòu)和形態(tài)截然不同的病毒粒子，即芽生型病毒(budded virus,BV)和多角體型病毒(occlusion-derived virus，ODV)。ODV病毒主要在感染晚期被大量包涵入多角體蛋白結(jié)晶[1]。2種表型的病毒在形態(tài)、蛋白質(zhì)組成和病毒囊膜的來源上都有所不同，導(dǎo)致在感染組織特異性以及病毒入侵宿主細(xì)胞方式上的差異[2]。關(guān)于質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)中多角體蛋白與病毒粒子之間相互作用的研究已有較多報(bào)道，但其包裝機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者推測，多角體蛋白和病毒之間可能存在特殊的識(shí)別作用，使多角體對病毒粒子進(jìn)行特異性的包埋[3]。目前在開發(fā)的桿狀病毒作為表達(dá)載體時(shí)，將多角體蛋白基因刪除，由外源目的基因替代，利用多角體強(qiáng)啟動(dòng)子帶動(dòng)外源基因的表達(dá)[4]，重組病毒不能形成多角體。Mori 等[5]利用改良的桿狀病毒表達(dá)載體，在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行 BmCPV 多角體蛋白基因的體外表達(dá)，結(jié)果表明，BmCPV 的多角體蛋白可以進(jìn)行自我包裝，在無其他病毒因子存在的情況下能夠組裝成多角體晶體結(jié)構(gòu)。

研究發(fā)現(xiàn)，多角體不僅可以對異源病毒粒子進(jìn)行包裝，還可以對一些異源蛋白進(jìn)行包埋[6]。對 CPV 多角體蛋白分子晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，質(zhì)型多角體是由同源結(jié)合的多角體蛋白分子三聚體相互作用組裝成的致密蛋白晶體結(jié)構(gòu)[1]，具有抗干燥、抗高溫的作用，以保護(hù)包埋其中的病毒粒子免受不良環(huán)境的破壞[7]。核型多角體病毒(BmNPV)能夠?qū)⒏腥炯?xì)胞內(nèi)表達(dá)的綠色熒光蛋白(EGFP)包埋進(jìn)多角體中，對包埋其中的EGFP起到抗干燥等保護(hù)作用[8]，并認(rèn)為EGFP是隨機(jī)進(jìn)入多角體中，且進(jìn)入多角體內(nèi)部的EGFP量很少。因此，筆者在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac)的基礎(chǔ)上，以多角體蛋白氨基端的 H1 α-螺旋序列作為多角體蛋白識(shí)別信號(hào)序列，將這種信號(hào)序列和綠色熒光蛋白基因gfp融合，并與 BmCPV 多角體蛋白基因共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白能夠被包埋進(jìn)多角體，為利用多角體固定外源蛋白提供技術(shù)平臺(tái)。

1材料與方法

1.1材料及主要試劑pFastBac Dual載體、大腸桿菌DH5α、DH10BacTM、Sf9昆蟲細(xì)胞，由江西省科學(xué)院微生物研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。Sf9 細(xì)胞用 Grace+10%胎牛血清(FBS)，于 28 ℃培養(yǎng)；Grace 培養(yǎng)基、胎牛血清為GIBCO/BRL 公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV、限制性內(nèi)切酶購自 Fermentas 公司；高保真 DNA 聚合酶、dNTPs、DNA凝膠回收試劑盒、T4 DNA 連接酶、MiniBest Bacterial Genomic DNA Extraction Kit、pMD18-T simple vector 載體等購自TaKaRa公司；DNA轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin購自Invitrogen公司；Western blot所用EGFP抗體購自Bio Vision公司；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker、X-gal、IPTG 購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2BmCPVpolyh基因片段和EGFP基因的克隆 根據(jù)BmCPV 基因組polyh序列 ( GenBank 登錄號(hào):GQ924589 )及Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)供體質(zhì)粒pFastBacHTB中多克隆位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

以江西省科學(xué)院微生物研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的pGEM-T easy/EGFP質(zhì)粒(帶有H1信號(hào)肽、柔性連接肽和EGFP的序列)為模板，用EGFP-F/EGFP-R引物擴(kuò)增EGFP基因序列片段。PCR產(chǎn)物(EGFP)與pMD18-T simple vector連接反應(yīng)按照說明書進(jìn)行。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的抽提等基因操作參照文獻(xiàn)[3-7]進(jìn)行。經(jīng)BamH Ⅰ和Hind III 酶切鑒定含有外源片段的重組質(zhì)粒pMD18-T- EGFP，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

以 BmCPV 中提取的 dsRNA 片段為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第 1 鏈。以 CPV-1和CPV-2為引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增多角體蛋白基因polhy。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化后克隆進(jìn)pMD18-T simple vector 載體獲得重組質(zhì)粒 pMD18-T-polyh。

表1　引物序列及所加入的酶切位點(diǎn)

1.3重組轉(zhuǎn)座載體與Bacmid穿梭載體的構(gòu)建將凝膠回收的polyh基因和pFastBac Dual質(zhì)粒經(jīng)過BamH I和Hind III雙酶切后分別回收，polyh基因定向克隆于FastBacDual的PH啟動(dòng)子下游，構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual-polyh轉(zhuǎn)化至DH5α，進(jìn)行PCR和酶切鑒定。

將上述pFastBac Dual-polyh質(zhì)粒和帶H1信號(hào)肽的EGFP基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)Smal I和KpnI雙酶切后分別回收，并將帶H1信號(hào)肽的EGFP基因定向克隆至pFastBac Dual-polyh的P10啟動(dòng)子下游，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual-polyh-EGFP,最后轉(zhuǎn)化至DH5α，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。

利用AcMNPV Bac-to-Bac系統(tǒng)，根據(jù)產(chǎn)品說明書構(gòu)建重組Bacmid (Invitrogen公司)：分別將pFastBac Dual/polyh-EGFP和對照質(zhì)粒pFastBac Dual轉(zhuǎn)化E.coliDH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂于含有X-Gal(40 μg/mL)、IPTG (24 μg/mL)、卡那霉素(50 μg/mL)、慶大霉素(100 μg/mL)和四環(huán)素(30 μg/mL)的培養(yǎng)基平板上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，48 h左右挑取白色菌落重新劃線，待長出白色菌落后接種于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，提取重組Bacmid DNA,用M13引物(M13-F和M13-R)PCR鑒定正確后，得到重組Bacmid：Ac-polyh/EGFP。

1.4重組病毒的構(gòu)建Ac-polyh/EGFP Bacmid DNA利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，具體操作過程參照Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑說明書。以綠色熒光和多角體的出現(xiàn)判斷重組病毒的產(chǎn)生，出現(xiàn)病變后收集上清進(jìn)行二次感染，獲得相應(yīng)的重組病毒。用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞數(shù)次，收集細(xì)胞。

1.5多角體的純化及包埋蛋白分析收集感染細(xì)胞，用30 mL PBS懸浮后超聲波破碎，15 000 r/min離心收集多角體。將Percoll與PBS按9∶1(V/V)混合，調(diào)pH至7.2，12 000 r/min離心20 min，收集純凈的多角體。最后將純化的多角體懸浮于含0.1% SDS的0.01 mmol/L PBS緩沖液中，室溫放置5 min，然后用PBS洗滌2次得到最終純化的多角體。

將純化后的多角體進(jìn)行12% SDS-PAGE分析，再將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，進(jìn)行Western blot檢測。使用的一抗為兔抗EGFP多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，最后使用TMB顯色。

2結(jié)果與分析

2.1重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual-polyh-eGFP的構(gòu)建BmCPV片段polhy dsRNA反轉(zhuǎn)錄后克隆進(jìn)pMD18-T，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-polhy，測序比對結(jié)果證實(shí)克隆片段為多角體蛋白基因(polhy)。pMD18-T-polh 經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后，克隆進(jìn)經(jīng)同樣酶切的pFastBac Dual載體獲得重組質(zhì)粒 pFastBac Dual-polyh。以pGEM-T easy/EGFP質(zhì)粒為模板，用EGFP-F/EGFP-B引物擴(kuò)增帶H1信號(hào)肽的EGFP基因片段，克隆入供體質(zhì)粒pFastBac Dual-polyh的P10啟動(dòng)子下游，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual-polyh-EGFP。

2.2重組病毒的構(gòu)建和多角體的形成以 pFastBac Dual-polyh-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AcMNPV Bac-to-Bac系統(tǒng)的E.coliDH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，得到同時(shí)表達(dá)polyh和EGFP基因的重組Bacmid：Ac-polyh/EGFP。Ac-polyh/EGFP用M13F和 M13R 引物進(jìn)行PCR鑒定和測序比對分析，結(jié)果表明外源基因片段插入至正確位置。將Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)所有感染的細(xì)胞內(nèi)都能觀察到大量的多角體，且發(fā)射出很強(qiáng)的綠色熒光(圖1)。從感染細(xì)胞中分離純化多角體，于熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)多角體能發(fā)射綠色熒光(圖2)。通過SDS-PAGE分析可見有29.0 ku左右的綠色熒光蛋白和31.0 ku左右的多角體蛋白同時(shí)得到表達(dá)，說明重組病毒構(gòu)建正確(圖3A)。

2.3多角體中包埋融合蛋白的分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證綠色熒光蛋白存在于多角體內(nèi)部，對純化后的多角體進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，結(jié)果表明，純化后的多角體中有29.0 ku左右的綠色熒光蛋白條帶能被綠色熒光蛋白的抗體所識(shí)別(圖3B、C)。表明綠色熒光蛋白與多角體蛋白可以同時(shí)表達(dá)，且綠色熒光蛋白都被包埋進(jìn)入多角體中。這說明該研究構(gòu)建的新系統(tǒng)不僅能夠形成多角體，外源基因也能夠得到較高水平的表達(dá)。

3結(jié)論與討論

注：A．正常光視野下；B．綠色熒光視野下。Note:A.Vision under normal light; B.Vision under green fluorescence.圖1　倒置熒光顯微鏡下的轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞(×400)Fig.1　Transfected Sf9 cells under inverted fluorescence microscope

注：A．正常光視野下；B．綠色熒光視野下。Note:A.Vision under normal light; B.Vision under green fluorescence.圖2　重組病毒感染Sf9細(xì)胞后純化多角體的熒光分析(×400)Fig.2　Fluorescence analysis of purified polyhedra after recombinant virus infected Sf9 cells

注：A.感染細(xì)胞Sf9的蛋白質(zhì)分析，M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),1.感染細(xì)胞sf9;B.純化多角體的蛋白質(zhì)分析,M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1.vAc-polgh,2.vAC-polyh/EGFP;C.多角體的Western blot分析,M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1.vAc-polyh,2.vAc-polyh/EGFP。Note:A.Protein analysis of Sf9 infected cells,M.Protein molecular standard,1.Infected Sf9 cells; B.Protein analysis of purified polyhedra,M.Protein molecular standard,1.vAc-polyh,2.vAc-polyh/EGFP; C.Western blot analysis of polyhedra;1.vAc-polyh,2.vAc-polyh/EGFP.圖3　進(jìn)入多角體內(nèi)部的外源蛋白EGFP的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.3　SDS-PAGE and Western blot analysis of exogenous protein EGFP into the inner of polyhedra

該研究構(gòu)建了一種能大量表達(dá)綠色熒光蛋白且可以形成多角體的重組病毒vAc-polyh/EGFP，當(dāng)該重組病毒感染Sf9細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白與多角體蛋白可以在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)，且所形成的病毒多角體中帶有一定量的綠色熒光蛋白。Ikeda等[9]和 Ijiri等[10]先后通過試驗(yàn)證明了 BmCPV 病毒核衣殼蛋白 VP3 的 N末端42 ～ 93 區(qū)域的 52 個(gè)氨基酸殘基和 CPV 多角體蛋白氨基端的 H1α-螺旋序列可作為多角體蛋白識(shí)別信號(hào)序列，將這種信號(hào)序列同外源蛋白基因融合，當(dāng)與多角體蛋白基因共表達(dá)時(shí)，外源融合蛋白能夠被包埋進(jìn)多角體。曹翠平等[3]將不同截短的多角體蛋白基因與EGFP基因融合表達(dá)，結(jié)果以多角體蛋白 N 末端 100 個(gè)氨基酸和完整多角體蛋白序列作為信號(hào)固定 EGFP 的效率最高。將EGFP基因、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt) 毒素基因與多角體蛋白基因按順序融合，構(gòu)建了可以同時(shí)表達(dá)多角體蛋白和融合蛋白的重組桿狀病毒，證實(shí)多角體既可以包埋桿狀病毒粒子[11]，又可以對 Bt 毒素和EGFP 進(jìn)行包埋。

關(guān)于多角體包裹目的蛋白的技術(shù)手段多是通過構(gòu)建2個(gè)重組桿狀病毒，即一個(gè)專一表達(dá)質(zhì)型多角體病毒多角體蛋白(包裹蛋白)的桿狀病毒，另一個(gè)專一表達(dá)目的蛋白的桿狀病毒，通過調(diào)節(jié)2種病毒的比例混合感染Sf9昆蟲細(xì)胞，再從細(xì)胞中分離出多角體[3，6，11]。該方法不適合從昆蟲細(xì)胞中收集大量的多角體，由于很多細(xì)胞在混合感染時(shí)只感染了一種病毒，所以會(huì)形成較多空多角體，以致于包裹效率低。該研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)將質(zhì)型多角體蛋白基因和目的蛋白基因分別構(gòu)建到pFastBacTMDual載體的PH與P10啟動(dòng)子下，并在綠色熒光蛋白與信號(hào)肽之間引入柔性鏈接肽，通過與病毒骨架重組，獲得重組桿狀病毒。通過該單一病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞，直接可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生所需要的包裹型蛋白，且這種重組型病毒也同樣可以獲得擴(kuò)增。相對于國外通過2種病毒按照比例進(jìn)行混合感染相比[8-9]，該研究工藝簡單，產(chǎn)生的包裹型蛋白效率更高，另外在產(chǎn)生包裹型蛋白的同時(shí)重組病毒粒子也獲得了擴(kuò)增，更適合通過昆蟲細(xì)胞發(fā)酵大規(guī)模制備多角體包裹型蛋白。多角體形成的分子機(jī)制不僅能夠更全面地解釋桿狀病毒的生物學(xué)特性，并能有效地解決蛋白質(zhì)不穩(wěn)定和難于長期保存的問題，有望在固定毒素蛋白、開發(fā)新型生物殺蟲劑以及開發(fā)基因治療新型載體和新型納米技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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Construction of Polyhedrin-plus Bac-to-Bac System for Embedded Exogenous Protein

GUO Jian-jun, YUAN Lin, ZENG Jing et al (Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang,Jiangxi 330096)

Abstract[Objective] To make clear the packing mechanism of the BmNPV polyhedra,a polyhedrin-plus Bac-to-Bac expression system for application in silkworm was constructed. [Method] On the basis of plasmid FastBacDual,four components were integrated,which wereEGFPgene as resistant marker，H1 signal peptide，polyhedrin gene from BmCPV and a flexible linker peptide. After enzyme digestion and ligation,high copy recombinant expression vector pFastBac Dual/polyh-EGFP was constructed. pFastBac Dual/polyh-EGFP was linearized and Ac-polyh/EGFP transferred into Sf9 cells. [Result] Using this new system, vBmBac(polyh+)-EGFP was constructed that the foreign gene and polyhedrin were both expressed at higher level and large amount of polyhedra were formed.Fluorescent microscopic observation demonstrated that EGFP and polyhedrin were expressed simultaneously,and the EGFP expression and polyhedra formation occurred in most of the jointly infected cells.Analysis of the purified polyhedra from jointly infected Sf9 cells showed that the foreign proteins were present in the polyhedra. [Conclusion]The result provide a new inspiration for efficient preservation of active proteins and development of new biopesticide with toxin protein and new delivery vector system for vaccines.

Key wordsBaculovirus; Polyhedra; Heterogeneous embedding

收稿日期2015-12-24

作者簡介郭建軍(1984-)，男，江西崇仁人，助理研究員，碩士，從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。

基金項(xiàng)目江西省重大科技創(chuàng)新項(xiàng)目(20124ACF01100)；江西省科學(xué)院項(xiàng)目(H2014004)。

中圖分類號(hào)S 182

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)02-184-04