劉 萍， 馬全英， 宋玉霞， 劉學榮， 牟克斌， 王超英， 董金杰

(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046)

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不同牛血清促懸浮培養(yǎng)BHK21細胞生長的作用

劉 萍， 馬全英， 宋玉霞， 劉學榮， 牟克斌， 王超英， 董金杰*

(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046)

摘要[目的] 驗證成年牛血清在細胞培養(yǎng)過程中對細胞的促生長作用。[方法]分別以商品胎牛血清、新生牛血清、處理的成年牛血清進行懸浮培養(yǎng)BHK21細胞，通過細胞密度、細胞活力等指標來檢測各血清對細胞的促生長作用。[結(jié)果]3種血清對細胞的促生長作用差異不明顯，都具有良好的促細胞生長作用。[結(jié)論]處理的成年牛血清具有良好的促細胞生長作用，與胎牛血清、新生牛血清促細胞生長作用差異不明顯。

關(guān)鍵詞牛血清；懸浮培養(yǎng)；BHK21細胞

血清是血漿中不含纖維蛋白原的膠狀液體,具有維持血液黏度、酸堿度、滲透壓等作用，主要由水和各種化學成分組成，這些化學成分包括白蛋白，α1、α2、β、γ-球蛋白，甘油三酯，總膽固醇，谷丙轉(zhuǎn)氨酶等[1-2]。血清中含有豐富的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、生長因子、激素、營養(yǎng)物及代謝物等，為細胞培養(yǎng)的順利進行提供了必要的營養(yǎng)保障。血清支持細胞的生長和繁殖能力是細胞培養(yǎng)過程中評價血清質(zhì)量最主要的指標之一，血清的選擇對細胞的培養(yǎng)具有十分重要的意義。研究表明，經(jīng)聚乙二酸(PEG)處理的成年牛血清可維持細胞培養(yǎng)需要的營養(yǎng)物質(zhì)，用于病毒或抗體的制備。筆者通過對胎牛血清、新生牛血清和處理的成年牛血清懸浮培養(yǎng)BHK21細胞，研究其增殖情況，以分析這3種血清促細胞生長的作用[3-4]。

1材料與方法

1.1血清來源胎牛血清購自gibco公司，批號：16000-044；成年牛血清購自鄭州益康生物工程有限公司，批號：201408021；新生牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司，批號：20131221。

1.2細胞與培養(yǎng)基低血清懸浮細胞BHK21為中農(nóng)威特生物科技股份有限公司馴化保存，低血清懸浮培養(yǎng)基為清大天一產(chǎn)品。

1.3試劑與儀器倒置顯微鏡，細胞分析儀(德國CASY)，搖床(ZHWY產(chǎn)品)，三角玻璃瓶等。

1.4成年牛血清的處理成年牛血清經(jīng)PEG處理后，過濾除菌。將處理后的成年牛血清進行蹄疫抗體和牛病毒性腹瀉抗體檢測。

1.5不同血清細胞培養(yǎng)試驗分3組，配制含10%的胎牛血清、新生牛血清和處理的成年牛血清的培養(yǎng)基。將懸浮BHK21細胞種子以約40萬/mL的接種量接種于含200 mL培養(yǎng)基的三角玻璃瓶內(nèi)，于37 ℃，90 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h，檢測細胞生長情況并進行細胞傳代培養(yǎng)，細胞傳10代培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，并對細胞進行形態(tài)觀察、細胞密度與細胞活力、微生物以及代謝等方面的檢測。

2結(jié)果與分析

2.1處理的成年牛血清檢測結(jié)果經(jīng)檢測，未處理的成年牛血清中口蹄疫抗體和牛病毒性腹瀉抗體均為陽性，胎牛血清和新生牛血清中口蹄疫抗體和牛病毒性腹瀉抗體均為陰性，處理后的成年牛血清中口蹄疫抗體和牛病毒性腹瀉抗體均為陰性(表1)。

表1處理后成年牛血清中口蹄疫抗體和牛病毒性腹瀉抗體檢測結(jié)果

Table 1The detection results of foot and mouth disease antibody and bovine viral diarrhea antibody of processed adult bovine serum

血清類型Serum口蹄疫抗體Footandmouthdiseaseantibody牛病毒性腹瀉抗體Bovineviraldiarrheaantibody未處理的成年牛血清Untreatedadultbovineserum陽性陽性處理的成年牛血清Processedadultbovineserum陰性陰性胎牛血清Fetalbovineserum陰性陰性新生牛血清Newbornbovineserum陰性陰性

2.2細胞在不同血清中的形態(tài)BHK21細胞經(jīng)懸浮培養(yǎng)48 h后，3種血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞均生長旺盛，飽滿透亮，生長良好，無明顯差異(圖1)。

注：A.胎牛血清培養(yǎng)基；B.新生牛血清培養(yǎng)基；C.成年牛血清培養(yǎng)基.Note: A　 Culture medium of fetal bovine serum; B. Culture medium of newborn bovine serum; C. Culture medium of adult bovine serum.圖1　血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)BHK21細胞形態(tài)Fig.1　The morphology of serum medium suspension culture of BHK21 cells

2.3細胞在不同血清中的生長情況BHK21細胞經(jīng)懸浮培養(yǎng)48 h后，3種血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞，細胞倍增時間在20 h左右，細胞密度均達300萬/mL以上，活力都在90.0%以上。細胞傳10代培養(yǎng)，10次試驗結(jié)果具有良好的重復性，細胞密度、細胞活力無明顯差異(表2)。

表23種血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)BHK21細胞48 h后的細胞密度和細胞活力

Table 2　Culturing results of 48 h in three kinds of serum medium

2.4細胞在不同血清中的代謝情況由圖1可知，在不同血清培養(yǎng)基中，細胞培養(yǎng)上清中的葡萄糖均隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低，培養(yǎng)前期下降較快，中后期下降減緩，至培養(yǎng)結(jié)束時，細胞培養(yǎng)上清中的葡萄糖濃度降至最低，分別為1.35、1.42、1.55 mmol/L。由圖2可知，在不同血清培養(yǎng)基中，細胞培養(yǎng)上清中的乳酸濃度均隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷積累，72 h時最大濃度分別為5.52、6.77、6.81 mmol/L。

圖1　不同血清培養(yǎng)基中葡萄糖消耗變化Fig.1　Changes of glucose consumption

圖2　不同血清培養(yǎng)基中乳酸濃度變化Fig.2　Changes of lactic acid concentration

2.5細胞在不同血清中的微生物污染情況

2.5.1細菌及真菌。肉眼及顯微鏡觀察均未發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液渾濁及存在活動的顆粒物。

2.5.2病毒。在細胞培養(yǎng)過程中,利用倒置相差顯微鏡觀察均未見病毒引起的細胞病變現(xiàn)象。

3結(jié)論與討論

細胞的生長是衡量血清質(zhì)量的一種評價方法。該試驗通過懸浮培養(yǎng)BHK21細胞來衡量胎牛血清、新生牛血清和成年牛血清的促細胞生長情況，結(jié)果表明，3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞增殖較快，活力較高，均生長較好，說明3種血清都能夠滿足細胞生長過程中所需的營養(yǎng)成分。

胎牛血清絕大部分的物質(zhì)來自于母體，含有豐富的胚胎發(fā)育過程中必需的一些生長因子和激素等，新生牛血清這些成分相對較少，新生牛血清和胎牛血清在細胞培養(yǎng)過程均能夠提供必需的營養(yǎng)成分。隨著牛月齡的增長，血清中不利于細胞培養(yǎng)的抗體、補體等成分增加，對于細胞生長增殖而言，這些大分子蛋白質(zhì)是一種異源物質(zhì)，給細胞增殖帶來不利影響。該試驗成年牛血清經(jīng)PEG處理后，口蹄疫抗體和牛病毒性腹瀉抗體檢測結(jié)果2種抗體均為陰性，表明成年牛血清經(jīng)PEG處理后，除去大部分不利于細胞生長的抗體、補體等大分子蛋白，而剩余的能夠滿足細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)成分，與報道結(jié)果一致[5]。經(jīng)PEG處理的成年牛血清除去了不利于細胞生長的大分子物質(zhì)，從而保持了維持細胞生長的營養(yǎng)物質(zhì)。該方法簡單，易于操作，成本廉價，且成年牛血清來源豐富，價格便宜，該研究為尋找一種替代新生牛血清或胎牛血清的方法奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] 宋紅英，高麗美，顧春燕，等.牛血清蛋白含量的高低對細胞生長的影響[J]. 浙江省醫(yī)學科學院學報，2005(3):37-39.

[2] 李倬，喬自林，馮玉萍,等.促細胞生長效應實驗對牛血清采血年齡的判斷的討論[J].西北民族大學學報，2003,24(3)：59-62.

[3] BARTELING S J.Use of polyethyleneglycol-treated serum for production of

foot-and-mouth disease virused cell cultures, in growing BHK-suspended cell cultures[J].Bull off Int Epizoot,1974,81(11/12):1243-1254.

[4] HANSEN M B,NIELS A S E,BERG K.Peaxaminnation and forther development of a precise and rapid dye method for measuring cell grow[J].Immunol methods,1989,119(2):203-210.

[5] MOSAN T.Rapid colorimetrie assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxivity assays[J].Journal of immunologial methods,1983,65(12):55-63.

The Effect of Different Bovine Serum on Promoting the Growth of BHK21 Cells in Suspension Culture

LIU Ping, MA Quan-ying, SONG Yu-xia, DONG Jin-jie*et al (China Agricultural Veterinary Biological Science and Technology Co. Ltd., Lanzhou, Gansu 730046)

Abstract[Objective] To verify the effect of bovine serum on promoting cells growth during cultivation process. [Method] Suspension culture of BHK21 cells was conducted by using commodity fetal bovine serum, newborn bovine serum and processed adult bovine serum respectively. The effect of each serum on promoting cells growth was tested through indicators of cell density and cell vitality. [Result] The difference among three kinds of serum on cell growth was not obvious, and they all had good effects on promoting cell growth. [Conclusion] The processed adult bovine has good effect on promoting cell growth, and has no obvious differences with that of fetal bovine serum and newborn bovine serum.

Key wordsBovine serum; Suspension culture; BHK21 cells

收稿日期2015-12-21

作者簡介劉萍(1977- )，女，山東單縣人，助理研究員，碩士，從事疫苗相關(guān)方面的研究。*通訊作者，副研究員，碩士，從事疫苗相關(guān)方面的研究。

中圖分類號S 188+.2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-177-03