白馬偉，趙 謙，和貴斌，張正學

(1.云南省蒙自市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南蒙自 661199；2.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明 650201)

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云南省昆明地區(qū)種雞J亞群禽白血病血清學調查

白馬偉1，2，趙 謙2，和貴斌2，張正學2

(1.云南省蒙自市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南蒙自 661199；2.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明 650201)

摘要[目的] 了解云南省昆明地區(qū)種雞場J亞群禽白血病的感染狀況。[方法] 從云南省昆明市疑似感染禽白血病的某種雞場采集644份泄殖腔(公雞)拭子和460份蛋清(母雞)樣品，采用ELISA法對種雞J亞群禽白血病進行抗原檢測。[結果] 在檢測的460份蛋清樣品中，172份抗原呈陽性，陽性率為37.39%；在檢測的644份泄殖腔拭子中，520份抗原呈陽性，陽性率為80.75%。A養(yǎng)殖場共檢測644份樣品，總陽性率為63.66%，其中蛋清樣品的陽性率為39.13%，泄殖腔樣品的陽性率為82.07%。B養(yǎng)殖場共檢測460份樣品，總陽性率為61.30%，其中蛋清樣品的陽性率為34.78%，泄殖腔樣品的陽性率為78.99%。此次檢測結果表明云南省昆明地區(qū)種雞群已嚴重感染J亞群禽白血病。[結論] 該研究可為種雞J亞群禽白血病的防治提供理論依據。

關鍵詞禽白血?。籎亞群；p27蛋白；ELISA

禽白血病(Avian leukosis virus，ALV)是指由反轉錄病毒科禽反轉錄病毒屬成員引起的雞的各種可傳播的良性和惡性腫瘤[1]。病雞表現(xiàn)為精神萎靡，食欲下降，羽毛蓬亂，隨著病情的發(fā)展出現(xiàn)典型的腫瘤性疾病，腿部、腳部皮膚部位出現(xiàn)突起狀腫塊；對病雞進行剖檢發(fā)現(xiàn)脾臟、肝臟腫大明顯，是正常的數(shù)倍。肝臟上可見大量灰白色的粟粒狀腫瘤；皮下毛囊部廣泛出血。禽白血病病毒基于其宿主范圍、病毒包膜干擾及交叉中和模式可以分為10個不同的病毒亞群(A~J)。它們也可以分為內源性和外源性的病毒，禽白血病A~D和J(Avian leukosis virus-J Subgroup，ALV-J)亞群是外源性的病毒。其中，J亞群禽白血病于1988年首次在英國被報道，隨后其他國家也檢測到該亞群病毒的存在[2]。1999年，在我國首次報道了J亞群禽白血病，繼而我國大部分地區(qū)相繼出現(xiàn)J亞群禽白血病感染的報道[3]。

J亞群禽白血病給我國的種雞養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失，從種雞育種親代到其后代的垂直傳播與其他ALV亞群相比更加頻繁。ALV-J誘發(fā)了多種腫瘤并在雞繁育方面造成了生產上的問題。J亞群禽白血病不僅可以通過垂直傳播，而且可以通過水平傳播，迄今為止該病還沒有有效的疫苗。目前，控制該疾病的主要方法是通過淘汰陽性雞，培育無白血病種雞群，最后達到雞群的全面凈化[4]。p27蛋白是禽白血病病毒的衣殼蛋白，在ALV-A、ALV-B和ALV-J亞群間的同源性高達90%以上，p27蛋白含量占病毒總蛋白的30%以上，對禽白血病的診斷具有重要意義，是目前檢測的首選抗原。目前，可以利用蛋清(母雞)、血清、泄殖腔(公雞)拭子等樣品來檢測雞群中ALV的感染狀況，由于血清樣品存在來自潛在的內源性序列的干擾，一般不用于檢測外源性病毒的樣品；蛋清(母雞)樣品和泄殖腔(公雞)拭子是目前進行抗原檢測的最快速、廉價、操作最為簡單的方法。筆者采用ELISA法對云南省昆明市蛋雞場的644份泄殖腔(公雞)拭子和460份蛋清(母雞)樣品進行ALV-J抗原檢測，了解云南省昆明市蛋雞場ALV-J的感染及流行情況，為分析種雞的感染狀況并制訂該病的防治措施提供一定的理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品。2015年1~2月，從云南省昆明市2個種雞場采集樣品1 104份，其中種公雞采集644份泄殖腔樣品，種母雞采集460份蛋清樣品。樣品均保存于-80 ℃冰箱中備用。采集樣品的相關情況見表1。

1.1.2主要試劑。 酶聯(lián)免疫吸附試驗所用的試劑盒，購自美國IDEXX公司。

1.1.3主要儀器。Multiskan FC 型酶標儀、移液器、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、振蕩器等均由云南農業(yè)大學動物科學技術學院動物傳染病實驗室提供。

表1　樣品采集情況

1.2方法

1.2.1樣品準備。收集母雞稀蛋清，將待檢雞蛋小的一端朝上放置，輕輕打碎蛋殼，在無菌條件下用移液器吸取上清，無需稀釋，裝于1.5 mL離心管中。于-79 ℃冰箱中反復凍融3次，以降低其黏稠度，將所收集的蛋清(母雞)放于4 ℃冰箱備用；將棉花拭子插入肛門2~3 cm處，自肛門周圍皺襞處拭取或在肛門口內輕輕旋轉涂擦，加到1.0 mL樣品稀釋液中冷凍，檢測前將樣品恢復至室溫，3 000 r/min下離心5 min，取上清用于抗原檢測。

1.2.2p27抗原的檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測泄殖腔(公雞)拭子中禽白血病病毒抗原，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

2結果與分析

由表2可知，共檢測樣品1 104份，其中692份樣品抗原呈陽性，陽性率為62.68%；蛋清(母雞)樣品460份，其中172份樣品抗原呈陽性，陽性率為37.39%；泄殖腔(公雞)樣品644份，其中520份樣品抗原呈陽性，陽性率為80.75%。A養(yǎng)殖場檢測644份樣品，其中410份樣品抗原呈陽性，陽性率為63.66%；蛋清(母雞)樣品276份，其中108份樣品抗原呈陽性，陽性率為39.13%；泄殖腔(公雞)樣品368份，其中302份抗原呈陽性，陽性率為82.07%。B養(yǎng)殖場檢測460份樣品，其中282份樣品抗原呈陽性，陽性率為61.30%；蛋清(母雞)樣品184份，其中64份樣品抗原呈陽性，陽性率為34.78%；泄殖腔(公雞)樣品276份，其中218份樣品抗原呈陽性，陽性率為78.99%。

表2　禽白血病抗原檢測結果

3結論與討論

該試驗采用ELISA法檢測云南省昆明地區(qū)規(guī)?；N雞場J亞群禽白血病抗原，結果表明該地區(qū)種雞場J亞群禽白血病抗原陽性率高達34.78%~82.06%，陽性率遠遠高于前人報道的抗原陽性率(8.3%~25.0%)[5-12]，這可能與昆明地區(qū)長期未對禽白血病足夠重視有關。此次檢測結果表明云南省昆明地區(qū)種雞群已經嚴重感染J亞群禽白血病，對禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展會造成嚴重影響。沈學懷等[13]采用ELISA法對泄殖腔棉拭子、雞血清、蛋清和病毒分離的細胞培養(yǎng)液進行ALV-p27抗原檢測，并利用RT-PCR方法檢測血液ALV特異性基因，結果表明血清、蛋清和細胞培養(yǎng)液作為ALV-p27抗原檢測材料的檢測陽性率均低于泄殖腔棉拭子，說明泄殖腔棉拭子是最靈敏的檢測材料。

作為感染性的病毒粒子進行傳播的禽白血病病毒是外源性白血病病毒，正常雞的基因組含有多類或多科禽反轉錄病毒樣成分，經遺傳進行傳播的禽白血病病毒稱內源性白血病病毒。該研究使用的ELISA試劑用于檢測禽白血病p27蛋白，p27蛋白作為ALV的群特異性抗原，因其序列保守并且含有許多抗原性強表位而成為制備檢測抗體的首選抗原[14-16]，對禽白血病的診斷具有重要意義。

公雞在禽白血病的流行中僅起到次要的作用，禽白血病病毒不在精細胞繁殖，因此公雞不能夠垂直傳播下一代，但公雞是病毒的攜帶者，也是一個傳染源。公雞泄殖腔(公雞)拭子檢出率高達80.75%，這可能與在飼養(yǎng)管理過程中雞只接觸頻繁使病毒在水平間傳播有關；此外，還可能與采集樣品時樣品中混有脫落的上皮細胞或者刺破腸黏膜而導致采集的樣品帶有血液，由于內源序列的干擾而導致泄殖腔(公雞)拭子的檢出率存在假陽性有關。

該試驗結果可為了解云南省禽白血病提供理論參考，為全面預防和控制禽白血病提供理論依據。隨著養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，禽白血病的問題將會更加突出，嚴重危害云南省蛋雞養(yǎng)殖業(yè)的健康、快速發(fā)展，因此有必要對云南省昆明地區(qū)J亞群禽白血病的感染情況進行調查研究，對其疫苗免疫等具有重要的實際意義與參考價值。

參考文獻

[1] 殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997：870-885.

[2] YUN B L，LI D L，ZHU H B，et al.Development of an antigen-capture ELISA for the detection of avian leukosis virus p27 antigen[J].Journal of virological methods，2013，187：273-283.

[3] CRITTENDEN L B.Retroviral elements in the genome of the chickens：Implications for poultry genetics and breeding[J].Crit Reu Poultry Biol，1991，3：73-109.

[4] 李中明.某蛋種雞群ALV流行病學及生物學特性的初步研究[D].泰安：山東農業(yè)大學，2010：100-103.

[5] 朱佩青，柏偉，成子強，等.禽白血病及其防控[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2014，30(2)：53-56.

[6] 齊新永，孫泉云，鞠龔訥，等.上海地區(qū)蛋雞J亞群禽白血病的血清學調查[J].動物醫(yī)學進展，2007，28(11)：110-111.

[7] 侯新華，劉東，王義，等.血管瘤型禽白血病研究進展[J].中國獸藥雜志，2012，46(2)：53-56.

[8] 齊巖，長賀楠，劉有昌，等.禽白血病的危害及防控[J].家禽科學，2010，6(5)：5-9.

[9] PAYNE L N，BROWN S R，BURNMSTEAD N，et al.A novel sub-group of exogenous avian leucosis virus in chickens[J].J Virol，1991，72(2)：801-807.

[10] 郝建勇，徐海孌，曹偉勝，等.蛋清樣品用于禽白血病病毒分離的效果評估[J].中國家禽，2014，36(16)：21-25.

[11] 陳晨，曹紅，陳富勇，等.抗禽白血病p27抗原單克隆抗體的制備與鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報，2005，27(4)：287-289.

[12] 羅青平，張蓉蓉，溫國元，等.2009年湖北省禽白血病的流行特點[J].中國家禽，2010，32(7)：47-48.

[13] 沈學懷，張丹俊，潘孝成，等.不同檢測材料對ELISA檢測禽白血病病毒-p27抗原結果的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42(5)：1294-1300.

[14] 馮敏，譚利強，代曼曼，等.種禽場J亞群禽白血病病原學調查及分離株遺傳進化分析[J].華南農業(yè)大學學報，2014，35(4)：11-15.

[15] SUKUPOLVI-PETTY S，AUSTIN S K，ENGLE M，et al.Structure and function analysis of therapeutic monoclonal antibodies against dengue virus type 2[J].J Virol，2010，84：9227-9239.

[16] GAO Y L，QIN L T，PAN W，et al.Avian leukosis virus subgroup J in layer chickens，China[J].Emerg Infect Dis，2010，16：1637-1638.

Serological Survey on J Subgroup of Avian Leukemia of Breeding Chicken in Kunming Area of Yunnan Province

BAI Ma-wei1,2, ZHAO Qian2, HE Gui-bin2, ZHANG Zheng-xue2(1. Mengzi Animal Animal Hygienic Supervision Institute of Yunnan Province, Mengzi，Yunnan 661199; 2. College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201)

Abstract[Objective] To understand the infection situation of J subgroup of avian leukemia (ALV) in breeding chicken farm in Kunming City of Yunnan Province. [Method] 644 cloaca swabs of cock and 460 albumen samples of hens were collected from a breeding chicken farm infected with suspected avian leukemia virus in Kunming City of Yunnan Province. The antigen of J subgroup of avian leukemia in breeding chicken was detected by using ELISA. [Result] Among 460 detected albumen samples, 172 antigen samples were positive, the positive rate was 37.39%. Among 644 cloaca swabs, 520 antigen samples were positive, the positive rate was 80.75%. 644 samples were detected in farm A, and the total positive rate was 63.66%. Among the detected samples, the positive rate of albumen samples was 39.13%, and the positive rate of cloaca swabs was 82.07%. 460 samples were detected in farm B, the total positive rate was 61.30%. Among them, the positive rate of albumen samples was 34.78%，and the positive rate of cloaca swabs was 78.99%. The detection results showed that the breeding chicken in Kunming City of Yunnan Province had been severely infected with J subgroup of ALV. [Conclusion] The research can provide theoretical basis for the prevention and control of J subgroup of ALV of breeding chicken.

Key wordsAvian leukemia; J subgroup; p27 protein；ELISA

收稿日期2015-12-28

作者簡介白馬偉(1974- )，男，云南蒙自人，獸醫(yī)師，碩士，從事獸醫(yī)防疫檢疫工作。

中圖分類號S 852.5

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-088-02