李海艷　李寶群　耿丹丹　程振宇

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室，河北　承德　067000)

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條件性味覺厭惡學(xué)習(xí)對大鼠舌乳頭上皮leptin的表達(dá)及上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

李海艷李寶群耿丹丹1程振宇

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室，河北承德067000)

〔摘要〕目的制備條件性味覺厭惡學(xué)習(xí)大鼠模型，觀察味覺厭惡學(xué)習(xí)(CTA)對舌乳頭上皮瘦素(leptin)表達(dá)的影響和超微結(jié)構(gòu)變化的影響。方法SD大鼠麻醉后，固定于腦立體定位儀上，于頂部切開皮膚，深達(dá)頂骨。經(jīng)皮膚切口處經(jīng)耳、眼間皮下組織導(dǎo)入聚乙烯管經(jīng)頰部穿入口腔，在頂骨表面打孔、上螺絲釘，用以固定導(dǎo)管，將味溶液經(jīng)導(dǎo)管注入口腔。術(shù)后3~5 d，經(jīng)導(dǎo)管向口腔內(nèi)注入0.2 mol/L蔗糖溶液5 ml，再腹腔注0.15 mol/L LiCl，建立味覺厭惡學(xué)習(xí)模型。灌流固定后取舌，采用免疫組化技術(shù)和電鏡方法來觀察舌乳頭上皮的情況。結(jié)果①leptin的陽性表達(dá)出現(xiàn)在舌乳頭上皮內(nèi)，且CTA組舌乳頭上皮的表達(dá)明顯高于對照組。②實驗組線粒體數(shù)目明顯減少，并出現(xiàn)水腫，嵴斷裂；細(xì)胞核不規(guī)則，核膜凹陷或形成核袋；細(xì)胞鑲嵌連接的縫隙變?。豢梢娙苊阁w。結(jié)論建立CTA動物模型后，表現(xiàn)為對甜味的明顯厭惡，CTA可影響leptin在舌乳頭上皮中的表達(dá)。而且一些細(xì)胞器形態(tài)異常，可能是動物自身的一種應(yīng)激反應(yīng)或保護(hù)機(jī)制。

〔關(guān)鍵詞〕味覺厭惡學(xué)習(xí)；瘦素；舌乳頭上皮

1河北醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室

第一作者：李海艷(1979-)，女，講師，碩士，主要從事動物形態(tài)與生理研究。

動物攝取某種新異的味覺刺激后，若出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉等內(nèi)臟不適，動物便可“記住”這種食物的味覺特征，減少或拒絕攝取具有相同味覺特征的食物，這種行為變化過程稱為條件性味覺厭惡學(xué)習(xí)(CTA)，是動物避免重復(fù)攝取有毒食物的一種重要學(xué)習(xí)機(jī)制。味覺對于調(diào)節(jié)攝食，控制體重起著重要的作用。其中由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的瘦素(leptin)能夠調(diào)整食物的吸收，能量的消耗和體重。目前認(rèn)為味覺器官是leptin作用于外周的靶器官之一，leptin抑制對甜味物質(zhì)的行為是通過作用于味覺細(xì)胞的ob-Rb受體，降低味覺感受器的敏感性。因此由leptin引起的味覺調(diào)整可能參與對食物吸收的調(diào)整〔1〕。本研究通過建立大鼠CTA模型，探討大鼠的學(xué)習(xí)記憶活動與leptin蛋白的關(guān)系。

1材料與方法

1.1動物及主要試劑成年雄性清潔級SD大鼠28只，體重250～300 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心〔許可證號：SCXK(冀)2008-1-003〕。購入后分籠飼養(yǎng)5～7 d，自由攝食和飲水，每日予以撫摩。隨機(jī)分為兩組：CTA組和對照組，每組14只。其中每組用來做免疫組織化學(xué)檢測10只，做電鏡檢測4只。leptin兔多克隆抗體干粉(PR-0205，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，用前PBS溶解，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB，Sigma公司)，戊巴比妥鈉，LiCl，水合氯醛等。

1.2口腔插管手術(shù)大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)后，腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉(45 mg/kg體重)麻醉，固定于腦立體定位儀上，手術(shù)暴露頂骨。將醫(yī)用單孔聚乙烯管的一端，由皮膚切口處經(jīng)耳眼間皮下組織導(dǎo)入大鼠頰部并穿入口腔，在口腔內(nèi)加一墊圈固定，在頂骨表面固定兩螺絲釘，將導(dǎo)管上端用牙托粉固定于螺絲釘上，傷口處灑上滅菌結(jié)晶磺胺消炎。

1.3CTA模型的建立口腔插管手術(shù)后3~5 d，經(jīng)口腔插管向口腔內(nèi)注入0.2 mol/L蔗糖溶液5 ml，5 min內(nèi)注完。20 min后，腹腔注0.15 mol/L的LiCl (20 ml/kg體重)，禁食禁水12 h后，用兩瓶法測定水和蔗糖的攝取量。如果對蔗糖的攝取量<0.5 ml，則說明建立了1次CTA。重復(fù)建立3次予以鞏固。

1.4免疫組織化學(xué)顯色造模成功后，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg體重)麻醉，打開胸腔暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管，150 ml生理鹽水灌流沖洗，麻醉后用4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(0.1 mol/L PB，pH7.4)，灌流固定1.5 h，取舌，一部分置于4%多聚甲醛固定用于光鏡觀察，另一部分用戊二醛固定用于電鏡觀察。用于光鏡觀察的經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm，每隔3片取1片。采用SP免疫組織化學(xué)顯示法測定大鼠舌的leptin表達(dá)水平。leptin兔多克隆抗體稀釋濃度為1∶300，DAB染色，蘇木素復(fù)染。陰性對照以PBS代替一抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其他步驟相同。在光學(xué)顯微鏡下觀察免疫陽性產(chǎn)物的分布，應(yīng)用Nikon顯微鏡Image-Pro Plus(IPP)分析軟件測量陽性產(chǎn)物的厚度。每只大鼠觀察6張切片，每張切片在200倍顯微鏡下取6個視野，單位面積內(nèi)leptin陽性細(xì)胞數(shù)(個/mm2)，取平均值作為該舌乳頭上皮leptin蛋白表達(dá)的相對水平。

1.5電鏡觀察切取兩組舌，切成約1 mm3的小塊，快速放入3.1%戊二醛固定2 h，1%OSO4后固定1 h，丙酮梯度脫水，常規(guī)電鏡包埋，半薄切片，光鏡下選區(qū)、定位，超薄切片，鈾-鉛雙染。透射電鏡下觀察上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并照相。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS14.0軟件行t檢驗。

2結(jié)果

2.1leptin陽性表達(dá)比較leptin陽性產(chǎn)為位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，廣泛分布在絲狀乳頭、菌狀乳頭以及輪廓乳頭上皮。CTA組與舌乳頭的上皮染色明顯加深；對照組絲狀乳頭和菌狀乳頭陽性上皮leptin的表達(dá)均比CTA組明顯降低(P<0.01)(圖1)。

2.2舌上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變對照組相鄰上皮細(xì)胞側(cè)面，質(zhì)膜相互凹凸相嵌，形成鑲嵌連接。細(xì)胞核大，較規(guī)則，有明顯的核仁，異染色質(zhì)少，常染色質(zhì)豐富。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少，核糖體豐富，可見橋粒。核膜清晰，可見雙層，異染色質(zhì)多，相鄰細(xì)胞膜形成鑲嵌連接。線粒體量較多，嵴清晰。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少，核糖體豐富，見圖2。CTA組舌上皮細(xì)胞之間的鑲嵌連接的縫隙明顯變小，橋粒較豐富，多數(shù)細(xì)胞核較規(guī)則，可見核仁。細(xì)胞核可見核袋，異染色質(zhì)較少，常染色質(zhì)豐富。有的染色體腫脹、嵴斷裂，有的染色體致密、嵴模糊。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少見，核糖體豐富，可見溶酶體。細(xì)胞核不規(guī)則，核膜凹陷或形成核袋。異染色質(zhì)較多，邊集在核膜表面。線粒體水腫，部分嵴斷裂或形成絮狀結(jié)構(gòu)。核糖體豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少見，見圖3。

對照組絲狀乳頭

CTA組絲狀乳頭

對照組菌狀乳頭

CTA組菌狀乳頭

圖2　對照組舌上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

圖3　CTA組舌上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

3討論

leptin主要在脂肪組織中表達(dá)，它被認(rèn)為是一種飽食信號，主要是調(diào)節(jié)能量平衡和控制體重。給遺傳性肥胖小鼠(ob小鼠)的腦脊液注入瘦素后，進(jìn)食量明顯減少，體質(zhì)量也逐漸下降到正常水平〔2〕。Monteleone等〔3〕和Waelput等〔4〕發(fā)現(xiàn)leptin具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)：一是通過與下丘腦的瘦素受體結(jié)合，它主要是抑制下丘腦弓狀核的表達(dá)和分泌神經(jīng)肽Y等多種神經(jīng)內(nèi)分泌激素的分泌，從而降低食欲，減少食物的攝入和減輕體重；二是作用于其他外周組織(包括肝臟、脾、肺、腎、心、胰腺)的瘦素受體，其中腦內(nèi)表達(dá)較高〔5〕。動物建立味覺厭惡學(xué)習(xí)后，有惡心、嘔吐、腹瀉等內(nèi)臟不適的表現(xiàn)，對攝食的適應(yīng)性調(diào)節(jié)能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致胃排空的延遲。而leptin水平及其受體表達(dá)的多少和性狀的改變，可以改變胃的順應(yīng)性，抑制攝食，延遲胃排空。原因是leptin直接激活迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)元，通過迷走神經(jīng)到達(dá)孤束核(NTS)刺激leptin敏感神經(jīng)元，再抑制胃運(yùn)動和排空〔6〕。敲除leptin受體基因的db/db小鼠，依然能建立條件性味覺厭惡學(xué)習(xí)，但是卻加快了CTA的消退過程。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是因為leptin受體廣泛分布在CTA相關(guān)的腦區(qū)〔7〕。此外在CTA形成和保持中，leptin受體的活性或功能發(fā)生變化，表明leptin在味覺和內(nèi)臟信息的相互作用中具有重要的作用〔8〕。但是動物建立CTA后是否會影響leptin的表達(dá)，目前尚未見到報道。

同時也有人通過半定量RT-PCR分析顯示ob-Rb受體在菌狀乳頭和輪廓乳頭的味蕾中有表達(dá)，但在周圍的上皮組織中表達(dá)的不是很清楚。在這3種不同組織中的表達(dá)，部分與味覺特異性G蛋白、alpha-gustducion很相似。其他的Ob-R在其他的味覺乳頭或者上皮組織都有廣泛的分布〔9，10〕。本研究結(jié)果提示瘦素在味覺厭惡學(xué)習(xí)中發(fā)揮一定的作用，可能參與了大鼠的學(xué)習(xí)記憶活動，充實了CTA理論。

目前有關(guān)建立CTA后對細(xì)胞器的影響報道較少。線粒體是真核生物能量和代謝的中心。目前已認(rèn)識到線粒體是細(xì)胞凋亡的“中心執(zhí)行者。本實驗提示細(xì)胞之間的通透性變差，以減少對甜味物質(zhì)的吸收，CTA組可見溶酶體，可能是大鼠建立CTA后，舌上皮出現(xiàn)水腫，細(xì)胞有壞死的情況?？傊ㄟ^實驗可以看出，動物建立CTA這一涉及厭惡情緒的模型后，導(dǎo)致了一些細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，可能是動物自身的一種應(yīng)激反應(yīng)或保護(hù)機(jī)制，探究其原因，還需要進(jìn)一步的研究。

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〔2014-08-19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R338

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0564-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.021