王建華　岳建華　張　輝　張克勤　姜　斌　傅　強(qiáng)

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東　濟(jì)南　250021)

?

大鼠陰莖組織中DDAH1和神經(jīng)型一氧化氮合酶的變化及其對(duì)勃起功能障礙的影響

王建華岳建華1張輝張克勤姜斌傅強(qiáng)

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東濟(jì)南250021)

〔摘要〕目的探討老年大鼠陰莖組織中不對(duì)稱二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)和神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)的變化對(duì)老年性勃起功能障礙(ED)的影響。方法隨機(jī)抽取3月齡與18月齡大鼠作為青年組與老年組，檢測(cè)兩組大鼠基礎(chǔ)陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)；電鏡觀察兩組大鼠陰莖海綿體組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異；采用ELISA方法檢測(cè)兩組大鼠陰莖組織中不對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)濃度；采用Western印跡檢測(cè)大鼠陰莖組織中DDAH1及nNOS表達(dá)水平。結(jié)果老年組與青年組基礎(chǔ)ICP無明顯差異(P>0.05)，注射罌粟堿后老年組ICP明顯低于青年組ICP(P<0.05)；電鏡發(fā)現(xiàn)老年組陰莖海綿體組織中內(nèi)皮下纖維化明顯；內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞器減少，線粒體聚集、腫脹明顯，細(xì)胞核變形、固縮時(shí)見。青年組組織內(nèi)未見明顯異常。ELISA發(fā)現(xiàn)老年組陰莖海綿體內(nèi)ADMA濃度明顯高于青年組(P<0.01)。Western印跡發(fā)現(xiàn)老年組陰莖組織中DDAH1與nNOS的表達(dá)明顯低于青年組(P<0.05)。結(jié)論增齡對(duì)陰莖組織中DDAH1和nNOS的影響是引起老年性勃起功能障礙的重要原因。

〔關(guān)鍵詞〕增齡；勃起功能障礙；二甲基精氨酸二甲胺水解酶1；神經(jīng)型一氧化氮合酶；不對(duì)稱二甲基精氨酸

1沂水中心醫(yī)院

第一作者：王建華(1988-)，男，在讀碩士，主要從事勃起功能障礙相關(guān)研究。

目前研究認(rèn)為老年性勃起功能障礙(ED)主要與陰莖組織內(nèi)一氧化氮(NO)濃度降低有關(guān)〔1〕。NO主要由一氧化氮合酶(NOS)催化產(chǎn)生，其中神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)在NO合成過程中起重要作用〔2〕。而不對(duì)稱二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH1)的代謝產(chǎn)物可以抑制NOS的活性進(jìn)而間接影響NO的合成〔3〕。本研究通過檢測(cè)大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)和陰莖組織中DDAH1和nNOS的表達(dá)，探討老年ED的發(fā)病機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器隨機(jī)抽取18月齡及3月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠(成都達(dá)碩生物科技有限公司提供)各10只，分別作為老年組和青年組。DDAH1抗體(兔IgG，Santa Cruz，美國(guó))、nNOS抗體(兔IgG，Santa Cruz，美國(guó))，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，PVDF膜，RIPA，PMSF，ECL發(fā)光試劑盒(Millipore，美國(guó))，大鼠睪酮酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Bioswamp，中國(guó))，酶標(biāo)儀(BIO-TEK，美國(guó))，凝膠成像儀(LAS-4000mini，美國(guó))，透射電鏡(JEM JEOL-1200EX，日本)，壓力換能器，BL-420V生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定大鼠稱重后給予2%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔注射，等待麻醉滿意，取仰臥位固定四肢，在下腹正中切開約3 cm縱行切口，分離陰莖及球海綿體肌。游離周圍皮膚。取兩個(gè)六號(hào)靜脈針，一個(gè)充滿肝素后與壓力換能器相連，另一個(gè)連接1 ml裝滿3 g/ml的罌粟堿的注射器。于陰莖頭體交界處平行將兩個(gè)針頭刺入海綿體兩側(cè)。用37℃生理鹽水浸濕紗布覆蓋切口，5 min更換一次紗布，使切口處保持恒溫。用BL-420V生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)記錄每只大鼠的基礎(chǔ)ICP，然后注入0.14 ml罌粟堿，記錄ICP變化。

1.2.2收集標(biāo)本大鼠心臟取血2 ml置于離心管中，4℃保存，待血液凝固后1 500 r/min離心15 min，上清液移至新EP管中，放入-80℃冰箱備用。處死大鼠后從陰莖根部取下陰莖組織，各修剪出1 mm×1 mm×1 mm立方體，放入電鏡組織固定液中，剩余組織放入-80℃冰箱備用。

1.2.3電鏡樣品制備組織塊先經(jīng)2%戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定1 h，PBS漂洗后梯度丙酮脫水，然后Epon812環(huán)氧樹脂包埋，切片機(jī)切片，用醋酸雙氧鈾-檸檬酸雙重染色，透射電鏡觀察。

1.2.4ELISA檢測(cè)ADMA將血清依次進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，加樣，溫育，洗滌，加酶，溫育，洗滌，顯色，終止，測(cè)定(均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作)。

1.2.5Western印跡檢測(cè)DDAH1、nNOS的表達(dá)取約100 mg陰莖海綿體組織于生理鹽水中，剪碎洗凈后加入PMSF與RIPA比例為1∶100的混合液適量，勻漿器研磨后于冰上靜置5 min。離心機(jī)內(nèi)20 000 r/min 4℃離心30 min，將上清吸到新EP管中，BCA法測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液后金屬浴變性。配置SDS-PAGE凝膠，吸取40 μg總蛋白，30 V電泳60 min壓線后改為100 V電泳約90 min。100 V轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉1 h，4℃冰箱內(nèi)一抗(1∶200)孵育過夜。洗膜后加入二抗室溫孵育2 h。再次洗膜，在成像儀中顯影，比較各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1ICP測(cè)定老年組與青年組基礎(chǔ)ICP無明顯差異〔(9.84±1.63)vs(10.66±1.66)mmHg,P>0.05〕；注射罌粟堿后兩組大鼠ICP均升高，老年組ICP明顯低于青年組〔(33.46±5.37)vs (39.71±3.67)mmHg,P<0.05〕。

2.2電鏡觀察陰莖海綿體組織電鏡下可見老年組大鼠陰莖海綿體組織纖維化明顯，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器減少，線粒體聚集、空泡化多見，細(xì)胞核固縮、核膜變形、異染色質(zhì)邊集時(shí)見。見圖1。

2.3ADMA測(cè)定老年組陰莖海綿體內(nèi)ADMA濃度為(61.04±4.19)μmol/g，青年組ADMA為(42.85±4.09)μmol/g。

2.4陰莖海綿體組織內(nèi)DDAH1、nNOS表達(dá)Western印跡結(jié)果顯示老年組大鼠陰莖組織內(nèi)DDAH1〔(0.90±0.06)vs(1.12±0.17)〕和nNOS〔(0.83±0.08)vs(1.07±0.11)〕的表達(dá)明顯低于青年組。見圖2。

圖1　陰莖海綿體組織電鏡觀察(×20 000)

圖2　兩組大鼠陰莖組織nNOS、DDAH1表達(dá)比較

3討論

ED是目前最常見的男科疾病之一，其發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸增加。據(jù)報(bào)道〔4〕，50歲以下ED的發(fā)病率不足10%，而60歲以上人群發(fā)病率超過20%。研究發(fā)現(xiàn)〔5〕ED的發(fā)病主要與陰莖組織中NO生成減少有關(guān)。NO是一種非腎上腺能非膽堿能的神經(jīng)遞質(zhì)，在介導(dǎo)陰莖海綿體動(dòng)脈平滑肌松弛的過程中發(fā)揮主要作用〔6〕。NO主要由NOS分解左旋精氨酸生成。nNOS是NOS的一個(gè)亞型，對(duì)勃起過程的啟動(dòng)發(fā)揮主要作用〔7〕。nNOS合成的神經(jīng)源性NO通過增加海綿體組織內(nèi)cGMP含量進(jìn)而通過一系列復(fù)雜反應(yīng)使陰莖迅速達(dá)到勃起狀態(tài)〔8〕。DDAH1主要分布在nNOS表達(dá)的區(qū)域〔9〕，其底物ADMA是NOS的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以通過降低NOS的活性減少NO的生成〔3〕。DDAH1是ADMA的分解代謝酶，超過70%的ADMA是由DDAH1分解代謝的〔10〕。因此nNOS和DDAH1兩者表達(dá)變化均可影響NO的生成，進(jìn)而影響陰莖發(fā)生ED。

研究發(fā)現(xiàn)，DDAH1與血管性疾病〔11〕以及血管病變引起的ED〔12〕有密切關(guān)系，但其對(duì)老年性ED的影響及其機(jī)制尚未清楚。本研究通過對(duì)比老年大鼠與青年大鼠罌粟堿誘導(dǎo)的ICP發(fā)現(xiàn)，老年大鼠ICP明顯低于青年組。而這一變化與陰莖海綿體內(nèi)DDAH1表達(dá)呈正相關(guān)，因此本研究認(rèn)為DDAH1可能降低老年大鼠ED。本研究還發(fā)現(xiàn)老年大鼠陰莖海綿體內(nèi)ADMA的濃度升高，ADMA在陰莖組織內(nèi)積聚，與NOS上的位點(diǎn)結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制了NOS的活性，最終使NO生成減少。這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了DDAH1對(duì)勃起功能的影響。Sydow等〔13〕研究證明DDAH1轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)ADMA濃度與對(duì)照組相比明顯下降，進(jìn)而可以提高NOS活性，增加NO的生成，改善勃起功能障礙。本研究還通過Western印跡方法比較老年大鼠與青年大鼠陰莖組織內(nèi)nNOS的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)老年大鼠陰莖組織內(nèi)nNOS的表達(dá)明顯降低。nNOS表達(dá)降低可直接導(dǎo)致神經(jīng)源性NO合成減少，使陰莖不能迅速達(dá)到勃起狀態(tài)。Dashwood等〔14〕通過免疫組化等方法證實(shí)在人類陰莖海綿體中nNOS表達(dá)下降可導(dǎo)致ED的發(fā)生，這與本研究的理論相符。

另外，Galiano等〔7〕認(rèn)為陰莖海綿體組織中的內(nèi)皮細(xì)胞生成NO減少是ED發(fā)生的主要原因，而本研究發(fā)現(xiàn)海綿體內(nèi)皮細(xì)胞電鏡下細(xì)胞器減少，線粒體聚集空泡化，細(xì)胞核異常等變化可能是ED的形態(tài)學(xué)病因。因此，本研究認(rèn)為DDAH1和nNOS表達(dá)減少可能是老年性ED發(fā)病的主要原因之一。

4參考文獻(xiàn)

1Levine AB，Punihaole D，Levine TB.Characterization of the role of nitric oxide and its clinical applications〔J〕.Cardiology，2012；122(1)：55-68.

2Hisasue S，Kato R，Suetomi T，etal.Age-related alteration of neurturin receptor GFRa2 and nNOS in pelvic ganglia〔J〕.Neurobiol Aging，2006；27(10)：1524-30.

3Paroni R，Barassi A，Ciociola F，etal.Asymmetric dimethylarginine (ADMA)，symmetric dimethylarginine (SDMA) and L-arginine in patients with arteriogenic and non-arteriogenic erectile dysfunction〔J〕.Int J Androl，2012；35(5)：660-7.

4Giuliano F，Droupy S.Erectile dysfunction〔J〕.Prog Urol，2013；23(9)：629-37.

5Lasker GF，Pankey EA，Kadowitz PJ.Modulation of soluble guanylate cyclase for the treatment of erectile dysfunction〔J〕.Physiology (Bethesda)，2013；28(4)：262-9.

6Aversa A，Bruzziches R，F(xiàn)rancomano D，etal.Endothelial dysfunction and erectile dysfunction in the aging man〔J〕.Int J Urol，2010；17(1)：38-47.

7Galiano M，Pignot G，Costa C，etal.Erectile dysfunction and cavernosal endothelial cells〔J〕.Prog Urol，2010；20(3)：188-93.

8Saenz DTI.Molecular mechanisms for the regulation of penile smooth muscle contractility〔J〕.Int J Impot Res，2002；14(Suppl 1)：S6-10.

9Leiper JM，Santa MJ，Chubb A，etal.Identification of two human dimethylarginine dimethylaminohydrolases with distinct tissue distributions and homology with microbial arginine deiminases〔J〕.Biochem J，1999；343 Pt 1：209-14.

10Pope AJ，Karuppiah K，Cardounel AJ.Role of the PRMT-DDAH-ADMA axis in the regulation of endothelial nitric oxide production〔J〕.Pharmacol Res，2009；60(6)：461-5.

11Liu X，F(xiàn)assett J，Wei Y，etal.Regulation of DDAH1 as a potential therapeutic target for treating cardiovascular diseases〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med，2013；2013：619207.

12Park K，Lee DG，Kim SW，etal.Dimethylarginine dimethylaminohydrolase in rat penile tissue：reduced enzyme activity is responsible for erectile dysfunction in a rat model of atherosclerosis〔J〕.Int J Impot Res，2009；21(4)：228-34.

13Sydow K，Mondon CE，Schrader J，etal.Dimethylarginine dimethylaminohydrolase overexpression enhances insulin sensitivity〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008；28(4)：692-7.

14Dashwood MR，Crump A，Shi-Wen X，etal.Identification of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in human penis：a potential role of reduced neuronally-derived nitric oxide in erectile dysfunction〔J〕.Curr Pharm Biotechnol，2011；12(9)：1316-21.

〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者：傅強(qiáng)(1968-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事勃起功能障礙相關(guān)研究。

基金項(xiàng)目：山東省科技攻關(guān)計(jì)劃(2007GG2N02074)

〔中圖分類號(hào)〕R698+.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)03-0553-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.016