張玉佩　孔怡琳　楊欽河　鄧遠軍　梁蔭基　金　玲　何毅芳　李媛媛　王觀龍　程少冰

(暨南大學醫(yī)學院，廣東　廣州　510632)

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SIRT1/UCP2通路在脂肪變性HepG2細胞線粒體能量代謝中的調(diào)控機制

張玉佩孔怡琳1楊欽河鄧遠軍梁蔭基金玲2何毅芳李媛媛王觀龍程少冰

(暨南大學醫(yī)學院，廣東廣州510632)

〔摘要〕目的采用油酸誘導HepG2細胞發(fā)生脂變，建立脂肪變性細胞模型，觀察SIRT1/UCP2通路在脂肪變性HepG2細胞能量代謝中的調(diào)控機制。方法采用含有2 mmol/L油酸的DMEM培養(yǎng)基誘導HepG2細胞24 h后，建立脂肪變性HepG2細胞模型，并設置對照組比較。以油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴形成狀況，并用全自動生化儀檢測細胞上清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)含量和細胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量；采用流式細胞儀測定線粒體膜電位的改變，采用磷鉬酸比色試劑盒測定細胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)含量，運用Western印跡法檢測各組細胞SIRT1和UCP2蛋白的表達。結果與對照組比較，模型組細胞內(nèi)橘紅色脂滴大量形成，且TG含量明顯升高(P<0.01)，線粒體膜電位及細胞內(nèi)ATP含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，SIRT1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，UCP2蛋白表達顯著升高(P<0.01)。結論油酸誘導的脂肪變性HepG2細胞模型可以出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂和線粒體能量代謝失衡，其機制可能與細胞內(nèi)SIRT1/UCP2通路的激活有關。

〔關鍵詞〕HepG2細胞；脂肪變性；SIRT1/UCP2通路；能量代謝

1廣東省中醫(yī)院大學城醫(yī)院2暨南大學附屬第一醫(yī)院

第一作者：張玉佩(1982-)，男，碩士，實驗師，主要從事中西醫(yī)結合防治慢性肝病研究。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)均無過量飲酒史，以肝細胞彌漫性脂肪病變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1是一種依賴于NAD+的去乙酰化酶，屬于表觀遺傳學中組蛋白修飾部分，可使多種蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；?〕。SIRT1可以促進脂類物質(zhì)大量被動員，并參與肝臟糖異生，同時影響著胰島素的分泌功能，在NAFLD的防治研究中逐漸引起重視〔2〕。解耦聯(lián)蛋白(UCP)2是一種哺乳動物所特有的線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)質(zhì)子跨膜轉運的作用，在NAFLD大鼠肝組織及脂肪變性肝細胞中UCP2基因和蛋白呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，與脂肪酸代謝關系密切〔3~5〕。本研究旨在觀察脂肪變性HepG2細胞的脂質(zhì)蓄積程度及SIRT1/UCP2通路與線粒體能量代謝之間的調(diào)控關系，以期在細胞水平探討NAFLD的發(fā)病機制。

1材料和方法

1.1材料HepG2肝癌細胞株由暨南大學醫(yī)學院生化教研室饋贈；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶購自美國hyclone公司；油酸購自美國sigma公司；油紅O染色試劑盒、細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒和三磷酸腺苷(ATP)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。日本日立公司全自動生化分析儀，OLMPUS熒光倒置顯微鏡。寧波新芝生物科技股份有限公司JY96-Ⅱ超聲細胞粉碎機，奧地利TECAN公司Tecan-safire2全波長多功能酶標儀，美國BD FACSAriaTM Cell Sorter 流式細胞儀。

1.2方法

1.2.1HepG2細胞培養(yǎng)HepG2細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，CO2濃度為5%。根據(jù)細胞生長情況，待細胞長至瓶壁80%~90%(約每2~3 d)，用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞并傳代，實驗中設置對照組和模型組，分別于6孔板中培養(yǎng)，每組各設6孔觀察。

1.2.2HepG2細胞脂肪變性模型的建立將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育貼壁48 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，參考Hwang等〔6〕的造模方法改進，予含2 mmol/L油酸的DMEM無血清培養(yǎng)基孵育HepG2細胞24 h，對照組為DMEM無血清培養(yǎng)基，油紅O染色鑒定。

1.2.3全自動生化儀檢測細胞上清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)含量變化細胞誘導成功后，將各培養(yǎng)孔中的細胞上清分別加入對應1.5 ml EP管中，用全自動生化儀檢測培養(yǎng)上清中ALT、AST含量變化。

1.2.4全自動生化儀檢測細胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量變化取完各孔細胞上清后，將細胞用PBS洗滌2遍，加入0.25%胰酶消化細胞，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基終止消化，并吹打細胞(確保將各孔內(nèi)的所有細胞吹下)，將各孔中的細胞懸液分別移入1.5 ml EP管中，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，棄上清；PBS洗滌細胞2遍，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，棄上清；將EP管置于冰上，每管各加入異丙醇300 μl；用超聲細胞粉碎機裂解細胞3 min；裂解后，離心(4℃，3 000 r/min，5 min)，取上清，全自動生化儀檢測上清中的TG含量。

1.2.5流式細胞術檢測細胞線粒體膜電位變化采用JC-1熒光探針檢測細胞線粒體膜電位變化，細胞誘導成功后，經(jīng)洗滌、消化，收集對照組和模型組的細胞，PBS重懸細胞，4℃離心5 min，棄上清，每管加入200 μl JC-1染液，混勻，37℃避光孵育15 min，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，棄上清，收集細胞，用500 μl 1×染色結合液洗2次，吸取500 μl 1×染色結合液重新懸浮細胞，混勻，在流式細胞儀上檢測，分析平均熒光強度值(MIF)。

1.2.6磷鉬酸比色法檢測細胞內(nèi)ATP含量變化細胞誘導成功后，經(jīng)洗滌、消化，收集對照組和模型組的細胞，PBS重懸細胞，離心(4℃，1 000 r/min，5 min)，棄上清，每管加入300 μl熱雙蒸水，置于熱水浴(95℃)中勻漿破碎15 min，后將細胞懸液置于沸水浴中加熱10 min，取出渦旋混勻1 min，采用ATP含量測試盒(磷鉬酸比色法)檢測，全波長酶標儀測定各孔吸光度值，計算每管ATP濃度。

1.2.7Western印跡法檢測細胞SIRT1和UCP2蛋白表達水平 取適量裂解液，使用前先加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使PMSF終濃度為1 mmol/L。計數(shù)細胞，按照每6×106個細胞加入1 ml RIPA裂解液，4℃離心5 min，根據(jù)碧云天BCA蛋白濃度試劑盒說明書對蛋白含量進行測定。HepG2細胞樣本進行凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、4℃過夜。洗滌后加入二抗，孵育，充分洗滌，然后進行化學發(fā)光、曝光、 顯影、 定影，最后對結果進行光密度掃描分析。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴變化對照組：細胞體積較小，細胞邊緣清晰，大部分細胞無明顯橘紅色脂滴蓄積，僅有少數(shù)細胞內(nèi)有少量橘紅色脂滴，顏色較淡；模型組：細胞明顯腫大，胞膜輪廓模糊，細胞內(nèi)可見較多橘紅色脂滴，并出現(xiàn)脂滴融合現(xiàn)象，部分脂滴甚至融合呈鏈狀或環(huán)狀。見圖1。

圖1　油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴(×400)

2.2細胞上清ALT、AST含量變化與對照組〔(3.17±0.41)、(8.83±0.75)U/L〕比較，模型組在誘導24 h后，細胞上清中的ALT〔(3.33±0.52)U/L〕、AST〔(10.5±5.17)U/L〕含量呈上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3細胞內(nèi)TG含量的變化與對照組〔(0.19±0.01)mmol/L〕比較，模型組的HepG2細胞內(nèi)TG含量〔(0.29±0.04)mmol/L〕明顯增高(P<0.01)。

2.4細胞線粒體膜電位的變化采用流式細胞儀檢測細胞熒光激發(fā)的強度，綠色熒光強度越高、線粒體膜電位越低。結果表明：對照組MIF為9 636±558，模型組MIF為7 214.7±1 335.1，與對照組比較，模型組線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2　細胞線粒體膜電位變化

2.5細胞內(nèi)ATP含量的變化與對照組〔(1 520.54±372.79)μmol/gprot〕比較，模型組ATP含量〔(949.8±193.76)μmol/gprot〕顯著降低(P<0.01)。

2.6細胞SIRT1、UCP2蛋白表達水平與對照組(0.475 2±0.173 9、0.135±0.067)比較，模型組SIRT1蛋白表達(0.141 1±0.393 8)顯著降低(P<0.05)，UCP2蛋白表達(0.653 4±0.123 8)顯著升高(P<0.01)。見圖3。

圖3　各組HepG2細胞SIRT1 和 UCP2蛋白的表達

3討論

無論在歐美還是亞洲，NAFLD已成為該地區(qū)發(fā)病率穩(wěn)居前列的慢性肝病，且呈低齡化發(fā)病趨勢〔7~9〕。研究表明NAFLD是糖脂代謝紊亂性疾病和心腦血管疾病發(fā)生的關鍵危險因素〔10，11〕，其發(fā)病危險指數(shù)呈快速上升的趨勢。HepG2肝癌細胞株是體外脂肪變性細胞模型重要載體，與肝細胞相比，其具有生物學功能相似和對脂毒性的耐受能力更強的特點，是國內(nèi)外誘導脂變模型使用最多的細胞〔12，13〕。

研究表明線粒體是脂肪酸進行β氧化、三羧酸循環(huán)、ATP合成和活性氧(ROS)形成的主要場所〔14〕，也是細胞代謝所需能量的主要來源，也是細胞內(nèi)氧化應激的源頭，肝臟脂質(zhì)蓄積越嚴重，肝細胞線粒體功能損傷越明顯〔15〕，線粒體呼吸鏈是ROS的主要來源，線粒體功能障礙會損害肝臟的脂肪穩(wěn)態(tài)，引起ROS的過量釋放，導致線粒體膜電位和呼吸鏈功能下降，ATP合成障礙〔16〕。線粒體膜流動性下降，脂肪在線粒體內(nèi)產(chǎn)生堆積，脂肪酸產(chǎn)生直接脂毒性，可造成線粒體腫脹，降低線粒體內(nèi)酶的活性，引起肝細胞線粒體功能障礙，從而誘導肝細胞的凋亡〔17〕。線粒體功能障礙還與脂質(zhì)過氧化關系密切，線粒體生物膜的磷脂、酶和膜受體相關多聚不飽和脂肪酸的側鏈及核酸等大分子物質(zhì)反應形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如丙二醛和壬烯，其能夠與線粒體蛋白結合和進一步損害線粒體呼吸鏈復合物，直接或間接的損害線粒體DNA，誘導線粒體產(chǎn)生更多ROS，形成惡性循環(huán)〔18〕。本實驗采用流式細胞術觀察到脂肪變性HepG2細胞線粒體膜電位明顯降低，同時該組細胞較對照組ATP含量下降、TG含量增加。由此推測，油酸誘導的脂肪變性細胞模型可以引起細胞內(nèi)脂肪酸代謝發(fā)生障礙，進而加重TG在細胞內(nèi)的蓄積，引起細胞線粒體膜電位降低，能量代謝發(fā)生障礙。線粒體能量代謝障礙與NAFLD發(fā)生、發(fā)展關系密切〔19〕，SIRT1/UCP2通路是細胞脂質(zhì)代謝和線粒體能量代謝調(diào)控的關鍵通路。SIRT1是一種核蛋白，能夠作為轉錄因子抑制UCP2轉錄活性，SIRT1通過與UCP2啟動子區(qū)的結合，抑制UCP2基因的表達，減少其編碼的線粒體內(nèi)膜蛋白的生成，從而抑制線粒體中解偶聯(lián)反應的發(fā)生〔20〕。在解偶聯(lián)狀態(tài)下，H+途徑ATP合成旁路從線粒體膜外重新進入膜內(nèi)，從而抵消跨膜質(zhì)子的電化學梯度，使線粒體產(chǎn)生氧化磷酸化解偶聯(lián)作用，阻止細胞內(nèi)線粒體通過呼吸方式將能量合成為ATP〔21〕。Della-Morte等〔22〕發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過活化SIRT1，抑制UCP2的表達，改善線粒體能量代謝，從而在腦缺血損傷大鼠中發(fā)揮神經(jīng)保護的作用。本研究結果提示油酸成功誘導HepG2細胞脂肪變性后，SIRT1蛋白對UCP2蛋白的調(diào)控作用受到抑制，線粒體解耦連效率降低，線粒體膜電位下降，從而使能量代謝發(fā)生障礙，由此可見，在NAFLD發(fā)病過程中，SIRT1/UCP2通路可能在線粒體能量代謝過程中發(fā)揮關鍵作用，并且未來可能成為防治NAFLD的潛在靶點。

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〔2015-09-14修回〕

(編輯袁左鳴)

Regulatory mechanism of SIRT1/UCP2 pathway in mitochondrial energy metabolism of steatotic HepG2 cells

ZHANG Yu-Pei, KONG Yi-Lin, YANG Qin-He,etal.

Medical College, Jinan University, Guangzhou 510632，Guangdong, China

【Abstract】ObjectiveTo establish a steatotic HepG2 cell model induced by oleic acid, and observe the regulatory mechanism of SIRT1/UCP2 pathway in energy metabolism of steatotic HepG2 cells.MethodsInduced by DMEM medium of 2 mmol/L oleic acid for 24 hours, the steatotic HepG2 cell model was successfully established.Then, lipid droplets in cytoplasm were observed by oil red O staining, while alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) in serum, and triglyceride (TG) accumulation in HepG2 cells were measured by automatic biochemical analyzer. The changes of mitochondrial membrane potential were determined by flow cytometry, and intracellular adenosine triphosphate(ATP) level was detected by biological reagent kit. The protein expressions of SIRT1 and UCP2 were analyzed by Western blot.ResultsCompared with those of control group, the level of TG accumulation was significantly higher(P<0.01), and lots of red lipid droplets inside cytoplasm were visible, while mitochondrial membrane potential and intracellular ATP levels were significantly reduced(P<0.05，P<0.01) in model group. The expression of SIRT1 protein was significantly lower(P<0.05), whereas the expression of UCP2 protein was significantly higher(P<0.01) in model group.ConclusionsThe oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells might result in lipid metabolism disorder and mitochondrial dysfunction, possibly by activating the SIRT1/UCP2 pathway in HepG2 cells.

【Key words】HepG2 cells; Steatosis; SIRT1/UCP2 pathway; Energy metabolism

通訊作者：楊欽河(1961-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，主要從事中西醫(yī)結合防治慢性肝病及脂代謝疾病研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81302878，81273617)；中國肝炎防治基金會天晴肝病研究基金(No.cfhpc20132184)；暨南大學第一臨床醫(yī)學院科研培育專項基金(No.2014205)；廣東省中醫(yī)藥局項目(No.20151224);廣東省醫(yī)學科研基金項目(No.A2015521)

〔中圖分類號〕Q493.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0513-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.001

·基礎研究·