肖松華　趙　君　劉劍光　吳巧娟　王義琴　儲成才俞敬忠　喻德躍

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) / 作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇南京210095;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 江蘇南京210014;3中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所, 北京100101

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轉(zhuǎn)天麻抗真菌蛋白基因提高棉花對黃萎病抗性

肖松華1,2趙君2劉劍光2吳巧娟2王義琴3儲成才3俞敬忠1,*喻德躍1,*

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) / 作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇南京210095;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 江蘇南京210014;3中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所, 北京100101

摘要:黃萎病是全球植棉業(yè)的主要病害, 嚴(yán)重缺乏抗黃萎病資源導(dǎo)致棉花抗黃萎病育種至今未取得顯著進(jìn)展。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法, 以下胚軸為受體, 將天麻抗真菌蛋白基因轉(zhuǎn)化陸地棉品系蘇研060, 通過愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷組織分化和植株再生, 獲得大量再生苗。分別以NPT II基因、gafp基因、35S啟動子-gafp基因特異引物對再生苗進(jìn)行PCR檢測, 將95個陽性再生苗嫁接到海7124幼苗砧木上, 獲得37個成活植株。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn), 31個植株出現(xiàn)預(yù)期的540 bp擴(kuò)增片段。盆栽花鈴期花粉育性鑒定表明, 9個轉(zhuǎn)基因植株雄性敗育, 22個植株花粉育性正常, 通過人工自交得到T1代種子。通過轉(zhuǎn)基因作物隔離區(qū)種植、特異引物PCR檢測、卡那霉素抗性篩選、自交純合與選擇, 培育獲得22個T3代轉(zhuǎn)基因純系。Southern blotting檢測發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)有2個gafp基因拷貝。GAFP蛋白免疫印跡表明, 16個轉(zhuǎn)基因純系出現(xiàn)分子量為14 kD的GAFP蛋白, 另6個純系表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默。黃萎病抗性鑒定結(jié)果證實(shí), 獲得3個抗落葉型黃萎病的棉花株系TG09、TG16和TG23。

關(guān)鍵詞:棉花; 天麻; 抗真菌蛋白; 基因; 黃萎病; 抗性

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08005), 國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2012AA101108), 國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD01B03), 江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20130699), 江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2013380)和江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目[CX(13)2024]資助。

This study was supported by the Major Project of China on New Varieties of GMO Cultivation (2014ZX08005), the National High-tech R&D Program of China (863 Program) (2012AA101108), National Key Technology Research and Development Program of the Ministry of Science and Technology of China (2013BAD01B03), the Natural Science Fund of Jiangsu Province (BK20130699), the Science-technology Support Plan of Jiangsu Province (BE2013380) and the Independent Innovation Fund for Agricultural Science and Technology of Jiangsu Province [CX(13)2024].

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: njxsh@sina.com

黃萎病是棉花生產(chǎn)上的主要病害, 暴發(fā)年份嚴(yán)重地影響著棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)。該病害自1935年伴隨美棉的引進(jìn)傳入我國后, 在國內(nèi)各產(chǎn)棉區(qū)逐漸擴(kuò)散。20世紀(jì)90年代以來, 棉花黃萎病危害逐年加重, 一般年份發(fā)病面積約占全國植棉面積的50％,每年損失皮棉達(dá)7.5～10.0萬噸, 直接經(jīng)濟(jì)損失16～ 20億元[1]。尤其是2002—2003年黃萎病在全國各主產(chǎn)棉區(qū)暴發(fā)成災(zāi), 重病田面積達(dá)300萬公頃以上,損失皮棉20萬噸以上, 直接經(jīng)濟(jì)損失超過40億元,已經(jīng)成為我國棉花生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙因素[2]。

采用病圃定向篩選, 未能在棉花抗黃萎病性狀的改良上獲得突破性進(jìn)展[3]。通過種間雜交將海島棉抗黃萎病性狀轉(zhuǎn)入陸地棉, 在中國、美國等國家育成一批黃萎病抗性有所提高的棉花新品種(系)[4-5],但海島棉抗源品種海7124、Pima 90-53對強(qiáng)致病力落葉型黃萎病菌系表現(xiàn)感病[6]。棉花抗黃萎病育種進(jìn)展緩慢的主要原因, 一是棉花黃萎病菌存在著多種生理小種的分化; 二是陸地棉中嚴(yán)重缺乏高抗黃萎病的種質(zhì)資源。利用基因工程技術(shù)將外源抗真菌病害基因?qū)朊藁? 為抗病育種提供了新的途徑。國內(nèi)外一些學(xué)者相繼報(bào)道, 分別將幾丁質(zhì)酶基因(chitinase, Chi)、β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase, Glu)、葡萄糖氧化酶基因(glucose oxidase, Go)、蘿卜抗真菌蛋白基因(Raphanus sativus antifungal proteins, Rs-AFPs)及幾丁質(zhì)酶與β-1,3-葡聚糖酶的融合基因?qū)腙懙孛? 培育出一些對黃萎病具有抗性的轉(zhuǎn)基因棉花新種質(zhì)系[7-9]。

天麻抗真菌蛋白(gastrodia antifungal protein, GAFP)是從我國傳統(tǒng)中草藥天麻中分離到的一種具有廣譜抗真菌活性的蛋白質(zhì), 對許多植物病原菌包括棉花黃萎病菌具有很強(qiáng)的抑制作用[10]。我國學(xué)者首先克隆了天麻抗真菌蛋白基因gafp[11], GenBank登錄號為AF225410。王義琴等[12]采用花粉管通道法以CaMV35S啟動子驅(qū)動的gafp基因轉(zhuǎn)化彩色陸地棉, 通過病圃篩選和分子檢測, 獲得高抗枯斑型黃萎病的轉(zhuǎn)gafp基因株系。陳大軍等[13]利用落葉型黃萎病圃對這些轉(zhuǎn)基因植株自交純合后代進(jìn)行抗病鑒定, 在10個供試的轉(zhuǎn)gafp基因彩色棉品系中, 僅有2個品系對落葉型菌系的抗性達(dá)到抗級。采取花粉管通道法開展植物轉(zhuǎn)基因研究, 存在著試驗(yàn)操作受人為因素和環(huán)境條件影響大、目的基因以隨機(jī)方式整合到受體染色體組中導(dǎo)致多拷貝整合以及轉(zhuǎn)基因植物后代遺傳方式復(fù)雜等問題[14-15]。為了提高gafp基因在棉株體內(nèi)的表達(dá)水平, 本研究通過對gafp基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建與優(yōu)化, 采取農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化陸地棉, 獲得抗落葉型黃萎病的棉花新種質(zhì), 緩解了目前我國棉花抗黃萎病資源嚴(yán)重匱乏的狀況, 為我國植棉業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了種質(zhì)保障和品種支撐。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

陸地棉品系蘇研060為轉(zhuǎn)化受體材料, 海島棉品系海7124為嫁接砧木。植物雙元表達(dá)載體pBI121、大腸桿菌菌株DH5α和根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404,由本實(shí)驗(yàn)室保存。維管束強(qiáng)啟動子竹節(jié)花黃斑駁病毒啟動子(P-CoY)由中國科學(xué)院微生物研究所提供, gafp基因兩種表達(dá)載體pBI121-35S-gafp和pBI121-CoY-gafp由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所構(gòu)建, 其質(zhì)粒T-DNA結(jié)構(gòu)如圖1-A、1-B所示。

1.2棉花遺傳轉(zhuǎn)化及再生植株P(guān)CR檢測

參照吳慎杰等[16]報(bào)道方法, 以下胚軸為外植體,采取農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化蘇研060。

取再生植株嫩葉2～3片, 采用CTAB法[17]提取植株基因組DNA, 進(jìn)行目的基因、啟動子——目的基因和標(biāo)記基因的PCR擴(kuò)增, 將陽性小植株嫁接到溫室內(nèi)砧木上。棉花再生植株P(guān)CR檢測所用特異引

物序列如下。gafp基因上游引物為5'-ATGGCCTC ACCCGCAAGCTCTG-3'; 下游引物為5'-CAGTGA TTGCAGCATTTCCAACG-3', 產(chǎn)物大小為433 bp。CoY-gafp/R的上游引物為5'-CACAATCCCACTATC CTTCG-3'; 下游引物為5'-CAGTGATTGCAGCATT TCCAACG-3', 產(chǎn)物大小為520 bp。選擇標(biāo)記基因NPT II的上游引物為5'-GAGGCTATTCGGCTAT GACTG-3'; 下游引物為5'-TAGAAGGCGATGCGCT GCGA-3', 產(chǎn)物大小為750 bp。

1.3再生植株嫁接

在裝有營養(yǎng)土的盆缽中種植根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)的海島棉品系海7124, 待棉苗3片真葉時(shí), 采用劈接法[16]將轉(zhuǎn)基因再生植株嫁接到砧木苗的接穗上,隨即使用保鮮膜裹緊、外加棉線扎窂。

圖1　gafp基因兩種表達(dá)載體T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)圖Fig. 1　T-DNA structure of two plant expression vectors harboring disease-resistant gene gafp

1.4嫁接成活植株的RT-PCR檢測

參照蔣建雄等[18]建立的CTAB/酸酚法提取棉花總RNA。RNA消化體系含50 μg總RNA、10 U DNase I、5 μL 10×DNaseI緩沖液、40 U RNase抑制劑, 用0.1％ DEPC溶液補(bǔ)足至50 μL。RNA消化流程為, 37℃溫育30～60 min, 用酚/氯仿抽提一次, 上層溶液加1/10倍體積的NaAc (pH 5.2)和2倍體積的無水乙醇, –20℃放置2 h后13 523× g離心20 min收集RNA沉淀, 沉淀用70％乙醇洗滌后真空干燥并溶解于20 μL 0.1％DEPC溶液中, 取1 μL溶液使用核酸蛋白分析儀測定其RNA濃度。

cDNA第1鏈的合成以5 μg RNA, 0.5 μg Oligo dT-Adaptor Primer, 加0.1％DEPC溶液至15 μL, 70℃水浴10 min, 置冰上; 再加1.25 μL dNTPs (10 mmol L–1)、0.625 μL RNase抑制劑(40 U μL–1)、5 μL 5×緩沖液、1 μL M-MLV (200 U L–1)、2.125 μL 0.1％ DEPC溶液, 于42℃培養(yǎng)1 h, 70℃ 10 min滅酶活。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍用于PCR擴(kuò)增模板。RT-PCR擴(kuò)增體系含1 μL cDNA稀釋樣、2 μL 10×PCR緩沖液、0.4 μL dNTPs (10 mmol L–1)、1.2 μL MgCl2(25 mmol L–1)、1 μL上下游引物(10 μmol L–1)、0.2 μL Taq聚合酶(5 U μL–1), 加超純H2O至總體積20 μL。gafp基因特異引物為, 上游引物5'-ATGGCCTCACC CGCAAGCTCTG-3'和下游引物5'-CGTATATGACA ACGTTACGGTC-3', 擴(kuò)增產(chǎn)物為371 bp。RT-PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s, Tm值復(fù)性1 min, 72℃延伸1 min, 28個循環(huán); 72℃延伸10 min。組成型表達(dá)的EF1α (GenBank登錄號為AJ223969)特異引物為, 上游引物5'-AGACCACCAAGTACT ACTGCAC-3'和下游引物5'-CCACCAATCTTGTAC ACATCC-3', 以其作為內(nèi)標(biāo)引物進(jìn)行平行PCR擴(kuò)增。

1.5轉(zhuǎn)gafp基因純合株系培育

2010年花鈴期對轉(zhuǎn)gafp基因工程植株進(jìn)行人工自交, 收獲T1代種子。2011年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因植物隔離種植區(qū)內(nèi), 將每個轉(zhuǎn)基因工程植株T1代種子種植成株行, 蕾期使用直徑1 cm2的濾紙蘸取2000 mg L–1的卡那霉素溶液, 放在植株倒二葉表面上, 7 d后觀察并統(tǒng)計(jì)抗、感植株數(shù)量, 并對抗性植株進(jìn)行人工自交, 收獲得到T2代種子。2012年在轉(zhuǎn)基因植物隔離種植區(qū)內(nèi), 種植卡那霉素抗性純合的株行, 進(jìn)行卡那霉素抗性檢測, 每個株系檢測30棵植株, 統(tǒng)計(jì)抗、感植株數(shù)量。對卡那霉素抗性純合的T2株系進(jìn)行人工自交, 獲得抗性純合的T3代株系種子。

從T1代植株上收獲得到T2種子, 進(jìn)行室內(nèi)卡那霉素抗性檢測。按單株收獲T2種子, 從中隨機(jī)選出50粒飽滿的種子, 在無菌條件下剝?nèi)シN皮, 接種于含2000 mg L–1卡那霉素的苗培養(yǎng)基上, 28℃培養(yǎng), 7 d后觀察子葉顏色變化情況, 綠色為抗性植株, 黃色為非抗性植株。

1.6Southern blot檢測

使用CTAB法[17]提取棉花葉片基因組DNA。采取以地高辛隨機(jī)標(biāo)記gafp基因全長作為探針、化學(xué)發(fā)光信號檢測為核心內(nèi)容的Southern雜交技術(shù)[19]。

1.7Western blot檢測

將提取的棉花葉片(七至八葉期幼嫩心葉)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離, 用半干法進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜,再與抗體反應(yīng), 最后使用NBT-BCIP染色試劑顯色[20]。抗體稀釋倍數(shù)一抗血清為1∶1000, 二抗為1∶4000。GAFP多克隆抗體和GAFP標(biāo)準(zhǔn)蛋白均由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供。

1.8轉(zhuǎn)基因株系黃萎病抗性鑒定

采用江蘇通州強(qiáng)致病力落葉型菌系V991作為鑒定菌種, 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.9苗期鑒定

以溫室為鑒定場所, 2013—2014年春季將T3代轉(zhuǎn)基因純系種子播種于紙質(zhì)營養(yǎng)缽中, 棉苗二葉一心時(shí)將營養(yǎng)缽撕底, 以達(dá)傷根目的。以黃萎病菌分生孢子懸浮液接種供試材料, 濃度為5×106個孢子mL–1, 每營養(yǎng)缽10 mL。以受體品系蘇研060和陽性空載株系作為對照。設(shè)置3次重復(fù), 在每個重復(fù)中,每個純系種植50株以上, 考察所有植株的發(fā)病情況。接種3周后調(diào)查發(fā)病情況, 按照五級分類標(biāo)準(zhǔn)[21],調(diào)查轉(zhuǎn)基因T3代株系、受體品系和陽性空載株系棉花葉片的病級。0級為健苗, 無病狀; 1級為1～2片子葉表現(xiàn)病狀, 子葉變黃發(fā)軟, 真葉不顯病癥; 2級為子葉和1片真葉表現(xiàn)病狀; 3級為子葉和2片真葉表現(xiàn)病狀; 4級為全部葉片表現(xiàn)病狀, 直到葉片脫落,頂心枯死。

1.10花鈴期鑒定

分別取黃萎病菌系V991病圃土壤和經(jīng)高壓鍋滅菌的營養(yǎng)土, 按照5∶1干重比例混合均勻, 裝入口徑38 cm、高40 cm的盆缽中。2013—2014年將轉(zhuǎn)基因T3代種子播于盆缽中。以受體品系蘇研060和轉(zhuǎn)空載體pBI121株系作為對照。設(shè)置3次重復(fù),在每個重復(fù)中, 每個純系種植50株以上, 鑒定所有植株的抗病表現(xiàn)。8月初調(diào)查發(fā)病情況, 按照五級分類標(biāo)準(zhǔn)[22], 逐株調(diào)查各供試株系和品系的葉片受害病級。0級為健株, 葉片無病狀; 1級為25％及以下的葉片表現(xiàn)癥狀, 即葉片出現(xiàn)葉肉變黃或呈現(xiàn)不規(guī)則形狀的黃色病斑; 2級為26％～50％葉片表現(xiàn)病狀,病斑顏色大部分變?yōu)辄S色或黃褐色, 葉片邊緣略有卷枯現(xiàn)象; 3級為51％～75％葉片表現(xiàn)病狀, 少數(shù)病葉凋落; 4級為76％及以上的葉片表現(xiàn)病狀, 多為褐色掌狀枯斑, 嚴(yán)重時(shí)葉片大量脫落, 甚至棉株枯死。

根據(jù)調(diào)查結(jié)果, 分別計(jì)算苗期、花鈴期各品系的發(fā)病率和病情指數(shù)。

在感病對照品種病情指數(shù)≥50的前提下, 按照病情指數(shù)劃分供試品種(系)的抗病類型(表1)。

采用Microsoft Excel和SPSS軟件進(jìn)行病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析。

表1　棉花黃萎病圃鑒定抗病性的劃分標(biāo)準(zhǔn)Table 1　Classification standard of cotton resistance to Verticillium wilt in nursery identification

2　結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

通過棉花體細(xì)胞再生途徑獲得了大量轉(zhuǎn)基因植株。分別以NPT II基因、gafp基因、CoY啟動子-gafp基因特異引物對再生苗進(jìn)行PCR檢測(圖2), 將3種檢測均為陽性的95個轉(zhuǎn)基因幼苗嫁接到海島棉品系海7124砧木上。

對嫁接成活的植株進(jìn)行RT-PCR檢測, 在37個嫁接成活的植株中, 有31個植株出現(xiàn)預(yù)期的540 bp擴(kuò)增片段(圖3), 另外6個植株中未擴(kuò)增出特征條帶。最終獲得31個T0代轉(zhuǎn)基因工程植株。

圖2　轉(zhuǎn)基因植株gafp基因、NPT II基因、CoY啟動子-gafp基因特異引物的PCR檢測Fig. 2　PCR analysis of the transgenic plants by using the primers of gafp, NPT II, and CoY-gafp, respectively

圖3　半定量RT-PCR分析gafp基因在棉花中的表達(dá)情況Fig. 3　Analyses of gafp gene expression in cotton by RT-PCR

2.2轉(zhuǎn)基因純合株系的獲得

追蹤T0代轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)化克隆發(fā)現(xiàn), 31個植株來自16個克隆, 其中G3系列克隆3個, 由35S啟動子-gafp基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而成; SG3系列克隆13個, 由CoY啟動子-gafp基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而成(表2)。

利用盆栽方式, 將31個轉(zhuǎn)基因植株種植在人工網(wǎng)室內(nèi), 防止花粉飄移污染其他棉花種質(zhì)資源, 冬季放入隔離溫室保存。花鈴期對轉(zhuǎn)基因植株花粉活力顯微鏡檢驗(yàn)表明, TG01、TG02、TG03、TG06、TG17、TG18、TG21、TG30、TG31等9個轉(zhuǎn)基因植株花藥空癟, 花粉敗育, 表現(xiàn)雄性不育(表2), 其他22個植株花藥飽滿, 散粉正常, 能夠正常開花結(jié)實(shí), 人工自交得到T1代種子。

將T1代轉(zhuǎn)基因種子種成株行, 按單株提取葉片基因組DNA, 進(jìn)行NPT II基因、gafp基因和CoY啟動子-gafp基因特異引物的PCR檢測。棉花蕾期田間檢測T1代每1棵植株的卡那霉素抗性, 檢測結(jié)果陽性的植株為轉(zhuǎn)gafp基因植株后代。對T1代轉(zhuǎn)基因植株人工自交, 分單株收獲T2代種子。在實(shí)驗(yàn)室對T2代種子進(jìn)行卡那霉素抗性檢測, 每個T1代單株后代檢測30粒種子, 全部表現(xiàn)卡那霉素抗性的判定為轉(zhuǎn)基因純合株系, 否則為雜合系。受體品系蘇研060發(fā)芽4 d后的幼苗表現(xiàn)對卡那霉素敏感, TG09、TG10和TG11等22個T2代轉(zhuǎn)基因株系和陽性空載對照全部表現(xiàn)卡那霉素抗性(圖4)。

表2　轉(zhuǎn)gafp基因工程植株及其純合株系的轉(zhuǎn)化克隆Table 2　Transformed clones of transgenic gafp engineering plants by Agrobacterium-mediated transformation in upland cotton

圖4　轉(zhuǎn)gafp基因棉花T2代株系TG09室內(nèi)卡那霉素抗性篩選Fig. 4　Screening for Kanamycin resistance of transgenic gafp plants of T2strain TG09 in laboratory

通過苗期NPT II基因、gafp基因和CoY啟動子-gafp基因特異引物的PCR檢測和蕾期主莖倒二葉卡那霉素抗性鑒定(圖5), 篩選獲得22個T2代轉(zhuǎn)基因純合株系。對T2代轉(zhuǎn)基因純合株系人工自交, 獲得22個T3代純合株系種子(表2)。

圖5　轉(zhuǎn)gafp基因棉花T2代株系TG23田間卡那霉素抗性篩選Fig. 5　Screening for Kanamycin resistance of transgenic gafp plants of T2strain TG23 in field

2.3轉(zhuǎn)基因純合株系Southern blot

以gafp基因的全長作為探針, 對TG09、TG12、TG16和TG23這4個T3代轉(zhuǎn)基因純合株系進(jìn)行Southern雜交驗(yàn)證, 4個轉(zhuǎn)基因純合株系均有2個拷貝的gafp基因整合到棉花基因組中(圖6)。

2.4轉(zhuǎn)基因純合株系Western blot

以22個T3代轉(zhuǎn)基因純合株系和受體品系蘇研060為材料, 進(jìn)行Western blot分析, 有16個株系出現(xiàn)分子量為14 kD的GAFP蛋白條帶(圖8, 泳道2、3、4、8),說明轉(zhuǎn)基因棉株體內(nèi)的gafp基因能夠準(zhǔn)確地翻譯成蛋白質(zhì); 然而TG04、TG05、TG11、TG24、TG25、TG26 等6個株系未出現(xiàn)GAFP蛋白特征條帶(圖7, 泳道5、6、7), 表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默[23-24]。

圖6　轉(zhuǎn)基因純合株系Southern雜交Fig. 6　Southern blotting of cotton genomic DNA by using gafp gene as probe in T3pure transgenic lines

圖7　轉(zhuǎn)基因純合株系Western雜交Fig. 7　Western blot of GAFP protein in T3pure transgenic lines

2.5轉(zhuǎn)基因純合株系黃萎病抗性鑒定

苗期接菌21 d后, 蘇研060及其陽性空載株系棉苗表現(xiàn)典型的感病癥狀(圖8-B), 發(fā)病率分別為88.99％、91.89％, 16個轉(zhuǎn)基因株系發(fā)病率為31.43％～ 62.20％, 明顯低于轉(zhuǎn)基因陰性、陽性對照, 表明轉(zhuǎn)基因棉花株系能夠阻滯黃萎病菌的入侵。轉(zhuǎn)基因株系之間、轉(zhuǎn)基因株系與對照之間在病情指數(shù)上存在極顯著差異, 其中TG09病情指數(shù)小于10, 高抗黃萎病(圖8-A), TG14、TG15、TG16、TG23病情指數(shù)介于10.1～20.0之間, 抗黃萎病, 其他株系病情指數(shù)介于20.1～35.0之間, 耐黃萎病, 蘇研060及其陽性空載株系病情指數(shù)均大于60, 感黃萎病(表3)。

花鈴期鑒定的結(jié)果, 蘇研060及其陽性空載株系發(fā)病率分別為97.37％、99.14％, 16個轉(zhuǎn)基因株系發(fā)病率為38.89％～77.78％, 明顯低于轉(zhuǎn)基因陰性、陽

性對照。轉(zhuǎn)基因株系之間、轉(zhuǎn)基因株系與對照之間在病性指數(shù)上存在極顯著差異, 其中TG09、TG16、TG23病情指數(shù)介于10.1～20.0之間, 抗黃萎病, TG10、TG12、TG13、TG14、TG15、TG22病情指數(shù)介于20.1～35.0之間, 耐黃萎病, TG07、TG08、TG19、TG20、TG27、TG28和TG29病情指數(shù)大于35, 感黃萎病, 蘇研060及其陽性空載株系病情指數(shù)均大于70, 感黃萎病(表3和圖9)。

花鈴期病土條件下鑒定的發(fā)病率和病情指數(shù)普遍高于苗期溫室鑒定, 但不同供試材料在2個時(shí)期對黃萎病的抗性表現(xiàn)趨勢一致(表3)?；ㄢ徠谑敲藁óa(chǎn)量、纖維品質(zhì)形成的關(guān)鍵時(shí)期, 利用供試材料花鈴期在人工病圃鑒定中的病情指數(shù)來評價(jià)棉花品種(系)對黃萎病的抗性具有實(shí)踐價(jià)值和可操作性[25],因此本研究以花鈴期病情指數(shù)作為評價(jià)轉(zhuǎn)gafp基因株系對黃萎病抗性的主要依據(jù)。結(jié)果表明, 從16個轉(zhuǎn)基因株系中, 篩選鑒定出3份抗黃萎病棉花新種質(zhì)TG09、TG16、TG23。

表3　轉(zhuǎn)基因純合株系抗黃萎病鑒定Table 3　Identification for resistance of pure transgenic gafp lines to Verticillium wilt in upland cotton

圖8　轉(zhuǎn)基因純合株系TG09苗期溫室接菌2周后的抗病性表現(xiàn)Fig. 8　Resistant phenotype of pure transgenic line TG09 to Verticillium wilt at seedling stage

3　討論

棉花組織培養(yǎng)生根困難, 提高試管苗的移栽成活率是棉花基因工程研究的技術(shù)瓶頸。在離體培養(yǎng)條件下, 棉花葉片角質(zhì)層很薄, 根系發(fā)育不夠, 移栽成活率低[26]。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法開展棉花基因工程研究時(shí), 在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入抗生素, 殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞并抑制農(nóng)桿菌的生長。使用抗生素篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞, 能夠大幅度地改變受體植物細(xì)胞DNA甲基化狀態(tài), 對植物愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖、分化等均有負(fù)面影響, 引起愈傷組織增殖變慢、再生植株頻率

低、生根困難、畸形苗比例增加、移栽困難, 難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)[27]。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)gafp基因轉(zhuǎn)化蘇研060, 通過PCR檢測獲得95棵陽性轉(zhuǎn)基因試管苗, 采用室外插皮接法將這些試管苗嫁接到砧木上, 僅獲得37個成活植株, 成活率38.95％。針對轉(zhuǎn)gafp基因試管苗嫁接過程中出現(xiàn)大量死苗現(xiàn)象, 后期研究開展棉花試管苗高效移栽技術(shù)的探索。若試管苗根系發(fā)育正常, 采用營養(yǎng)液水培法結(jié)合煉苗, 能夠?qū)⒃嚬苊缰苯右圃缘綘I養(yǎng)缽中, 成活率高達(dá)95％以上; 若試管苗根系發(fā)育不良, 采用試管內(nèi)嫁接法結(jié)合生根培養(yǎng), 成活率高達(dá)92％以上。兩種方法結(jié)合使用能夠大幅度地提高試管苗的移栽成活率, 推動棉花基因工程研究的深入發(fā)展。

轉(zhuǎn)gafp基因棉花工程植株及其衍生株系出現(xiàn)雄性敗育、基因沉默等異?，F(xiàn)象, 探究其形成原因有利于優(yōu)化植物表達(dá)載體的構(gòu)建技術(shù), 同時(shí)為棉花突變體庫的創(chuàng)建提供理論依據(jù)。本研究從37個成活的轉(zhuǎn)基因植株中, 最終僅獲得16個gafp基因在棉株體內(nèi)能夠穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系。大量研究表明, 采取農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因植物, 目的基因進(jìn)入受體基因組后, 可能引起受體DNA片段重排、丟失、異常重組, 而且目的基因在受體基因組內(nèi)整合的隨機(jī)性以及多拷貝整合, 導(dǎo)致目的基因在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)出現(xiàn)多種表達(dá)方式, 可能出現(xiàn)目的基因高效表達(dá)、表達(dá)量過低、基因沉默、或干擾受體基因組其他功能基因的正常表達(dá)等現(xiàn)象[28-29]。目的基因可以插入植物染色體組任何一條染色體的任何位點(diǎn), 但對轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域具有優(yōu)先插入特性。通過對轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)T-DNA結(jié)構(gòu)、邊界序列和目的基因在染色體上的位置與其表達(dá)狀況的相關(guān)性研究, 發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定遺傳和持續(xù)表達(dá)的基因位點(diǎn)上, 除含有簡單的T-DNA序列外, 兩端或至少一端旁側(cè)富含AT序列,并在體外能與核基質(zhì)結(jié)合; 而在不穩(wěn)定表達(dá)的位點(diǎn)上, 含有多個不完整的T-DNA拷貝, 載體DNA直接與T-DNA右邊界相連。FISH結(jié)果進(jìn)一步表明, 整合在端粒附近的目的基因能夠穩(wěn)定表達(dá), 而整合在染色體臂內(nèi)或著絲粒附近的目的基因就不能穩(wěn)定表達(dá),說明目的基因T-DNA整合的完整性以及在染色體上整合的位置對外源基因穩(wěn)定表達(dá)至關(guān)重要[30-31]。

圖9　轉(zhuǎn)基因純合株系TG16花鈴期病土條件下抗病性表現(xiàn)Fig. 9　Resistant phenotype of pure transgenic line TG16 to Verticillium wilt at flowering and boll setting stage

4　結(jié)論

已將gafp基因?qū)腙懙孛? 轉(zhuǎn)基因株系均有2個拷貝的gafp基因整合到棉花基因組中。16個T3代轉(zhuǎn)基因株系出現(xiàn)分子量為14 kD的GAFP蛋白條帶。獲得3份轉(zhuǎn)基因抗黃萎病棉花新種質(zhì)TG09、TG16、TG23。

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Transgenic Upland Cotton Lines of Gastrodia Antifungal Protein Gene and Their Performance of Resistance to Verticillium Wilt

XIAO Song-Hua1,2, ZHAO Jun2, LIU Jian-Guang2, WU Qiao-Juan2, WANG Yi-Qin3, CHU Cheng-Cai3, YU Jing-Zhong1,*, and YU De-Yue1,*
1Nanjing Agricultural University / National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095, China;2Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;3Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Abstract:Verticillium wilt is a major disease in worldwide cotton production. Up to now there are less progresses achieved by using conventional cotton breeding for controlling Verticillium wilt of upland cotton owing to lack of broad-spectrum resistant germplasm. The most effective approach of controlling cotton Verticillium wilt could be to create new strains with broad-spectrum resistance and then develop cultivars with improved horizontal resistance through transgenic manipulation. Transferring the gene of gastrodia antifungal protein (gafp) into upland cotton variety Suyan 060 was carried out by agrobacterium-mediated genetic transformation. Many regenerated plantlets were gained through embryogenic callus induction and plant regeneration by using hypocotyls as explants. PCR detection of plantlets using special primers from functional region of the target gene was performed and 95 positive plantlets were acquired. Thirty seven transgenic plants were eventually generated by grafting of all plantlets to Hai

7124 stock, and the survival rate of grafting reached 38.95％. RT-PCR results indicated that the characteristic band of 540 bp amplified fragment appeared in 31 plants while disappeared in the rest six plants. Pollen fertility identification in blossom stage showed that nine transgenic plants displayed male sterile, 22 plants performed male fertile and self-fertilized to T1seed. Twenty two pure T3transgenic gafp lines were identified by cultivating in the isolation area specific to transgenic crops, PCR detection using primers from functional region of gafp gene, kanamycin-resistance screening, self-fertilized purification and selection. Southern blotting showed that there were two copies of gafp gene integrated into the cotton genome. Western blotting confirmed that 16 pure transgenic lines had GAFP protein with molecular weight of 14 kD, the other six lines lacked the protein due to posttranscriptional gene silencing. Identification of resistance to Verticillium wilt indicated that three pure transgenic gafp lines TG09, TG16, TG23 were resistant to defoliated strain V991 of Verticillium wilt.

Keywords:Upland cotton; Gastrodia elata; Antifungal protein; Gene; Verticillium wilt; Resistance

收稿日期Received(): 2015-05-29; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2015-12-07.

通訊作者*(Corresponding authors): 俞敬忠, E-mail: zhoucui6868@163.com; 喻德躍, E-mail: dyyu@njau.edu.cn

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00212